PI3K和MLCK活性抑制劑(Wortmannin)-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X10287

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學(xué)檢測。

中文名稱：PI3K和MLCK活性抑制劑(Wortmannin)

英文名稱：Wortmannin

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg

貨號：FS-X10287

產(chǎn)品介紹:

英文名稱：Wortmannin

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg

Wortmannin是一種多靶點抑制劑，抑制PI3K和MLCK活性，IC50分別為3nM和200nM。并有效抑制DNA-PK和ATM，IC50分別為16nM和150nM。

注：本品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號：19545-26-7

別名：SL-2052;KY-12420

純度：99.65%

分子量：428.43

儲存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請盡量在一個月內(nèi)使用。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

出芽短梗霉活化蛋白激D抗體Human PSMB3 乙呋(AD)

異常威克漢姆酵母Jun激活區(qū)域-連接蛋白1抗體Human PSMD2 胰脂肪(PL)

大腸埃希氏菌磷化蛋白酪激JAK-2抗體Human PSMB6 胰抑制(Pancreastatin)

黑曲霉蛋白酪激JAK-3抗體Human PSMD3 胰激肽原(PK)

Cystofilobasidium磷化蛋白酪激JAK-3抗體Human PSMD5 胰高血糖樣肽2受體(GLP2R)

黑曲霉磷化蛋白酪激JAK-3抗體Human PSMB7 胰高血糖樣肽2(GLP2)

球孢白僵菌磷化原癌基因c-Jun抗體Human PSMC2(Proteasome 26S subunit ATPase 2) 胰高血糖樣肽1受體(GLP1R)

黑曲霉蛋白質(zhì)酪激JAK2抗體Human CECR1(Adenosine deaminase CECR1) 胰高血糖樣肽1(GLP-1)

釀酒酵母JWA蛋白抗體Human PSMC1 胰高血糖(GC)

燕麥鐮孢連接蛋白JPH3抗體Human PSMC4(Proteasome 26S subunit ATPase 4) 胰多肽(PP)

釀酒酵母連接粘附分子C抗體Human PSMC6(Proteasome 26S subunit ATPase 6) 胰淀(Amylin)

厚環(huán)乳牛肝菌蛋白質(zhì)酪激JAK-1抗體Human PSMD10 胰淀粉(PAMY)

拜耳接合酵母組蛋白去甲基化JMJ2A抗體Human PSMD11 胰島抗原2抗體/蛋白酪磷抗體(IA-2A)

根霉組蛋白去甲基化JMJD5抗體Human HNRNPA2B1(Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1) 胰島抗體(ICA)

多育曲霉磷化γ連環(huán)蛋白抗體Human PSG4 胰島自身抗體(IAA)

布魯氏菌生物Ⅰ型JNK相互作用蛋白4抗體Human PSAPL1 胰島原(PI)

小紅酵母Rhodotorula│minuta 質(zhì)量規(guī)格：>92.0%(T)葒草

粉紅聚端孢霉Trichothecium│roseum (Pers.) Link 質(zhì)量規(guī)格：>99.0%(GC)野百合堿

尖孢枝孢Cladosporium│oxysporum Berk. & M.A. Curtis 質(zhì)量規(guī)格：>95.0%(HPLC)(T)桔梗皂D
PI3K和MLCK活性抑制劑(Wortmannin)油菜假單胞 2-氨基-5-溴-3-硝基吡啶利鈉肽受體B

弗蘭克氏 2-溴-4-硝基吡啶白抗原G5

腐皮殼苯硅烷Smad同源物3

短短芽胞桿 1,3-二甲基吡唑Smad同源物4

洋蔥青霉 1,5-二甲基-1H-吡唑Smad同源物6

新疆鹽紅 2-溴-5-氟甲酯Smad同源物7

耐林丹黃桿 2-溴-5-氨基甲酯能受體P2X7

熒光假單胞 4-溴鄰苯二甲酰亞酪激受體

腐皮鐮孢 4--2,6-二氟苯P物質(zhì)受體

枯草芽孢桿 3-溴苯酞抗SSA IgG抗體

東方伊薩酵母 4-溴-1,3-苯二甲抗SSB IgG抗體

萊比托游動球 N-叔丁基甘鹽鹽谷氨酰?；h(huán)化

熱帶假絲酵母 5-甲氧基-2-巰基-4-嘧啶肌激同工MB

中山乳芽胞桿中山亞種己芐酯肽基脯氨酰順反式異構(gòu)NIMA相互作用蛋白1

猴頭 1-溴-2,4-二甲基-5-（易）腫瘤壞死因子受體超家族成員11A
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)