細胞固定/破膜試劑盒-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9850

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學(xué)檢測。

中文名稱：細胞固定/破膜試劑盒

英文名稱：

產(chǎn)品規(guī)格：150ml

貨號：FS-X9850

產(chǎn)品介紹:

固定液、破膜劑用于細胞內(nèi)細胞因子染色前對細胞膜的處理。固定液起穩(wěn)定細胞膜、保持細胞膜表面抗體與抗原結(jié)合的作用；破膜劑使流動的、完整的細胞膜產(chǎn)生小孔以利于抗體進入細胞。用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)抗原及DNA時，對待測細胞進行固定、破膜處理后，加入相應(yīng)抗體或檢測試劑，孵育一定時間即可上機分析。

儲存條件：4℃避光保存，勿冰凍。

有效期：一年。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

4-[2-(5-基吡-2-?；?乙基]磺酰...英文名： Quetiapine Fumarate20號染色體開放閱讀框194抗體包裝250g

4-[2-(5--2-氧基酰)-乙基]-磺...英文名： Quetiapine Fumarate4號染色體開放閱讀框32抗體包裝50g

4-基安替林（標準品）英文名： Raltegravir K5號染色體開放閱讀框20抗體包裝100g

4-羥基（標準品）英文名： Raltegravir胱抑D/半胱蛋白抑制劑D抗體包裝25g

4-羥基芐;對羥基(標準品)英文名： Rapamycin(Sirolimus)胱抑8/半胱蛋白抑制劑8抗體包裝10g

4-羥基間二（標準品）英文名： Rapamycin(Sirolimus)胱抑9/半胱蛋白抑制劑9抗體包裝50g

4-異丁基（標準品）英文名： Rasagiline Mesylate胱抑S/半胱蛋白抑制劑S抗體包裝1g

4－[2－（5--2－氧基酰）－乙基]－磺...英文名： Resveratrol煙堿型乙酰受體α3抗體包裝25g

4－差向四環(huán)（標準品）英文名： Resveratrol3號染色體開放閱讀框33抗體包裝5g

5'-脫氧-5-胞(5’-DFCR)(標準品)英文名： Retigabine Base3號染色體開放閱讀框39抗體包裝25g

5-基楊,美秦(標準品)英文名： Retigabine3號染色體開放閱讀框59抗體包裝5g

5-基-2,4-戊二烯(標準品)英文名： Ribavirin5號染色體開放閱讀框51抗體包裝1g

5-氮胞/阿扎胞(標準品)英文名： Ribavirin3號染色體開放閱讀框70抗體包裝5g

5-基蜂蜜曲霉（標準品）英文名： Ribostamycin Sulfate2號染色體開放閱讀框68抗體包裝1g

5-羥基色(標準品)英文名： Rifabutin 2號染色體開放閱讀框47抗體包裝1g

酵母菌Saccharomyces│sp. 質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR,可用于培養(yǎng)血小板膜糖蛋白Ⅳ試劑盒異甘草;Isoliquiritigen

原小單孢菌屬菌種Promicromonospora│sp. 質(zhì)量規(guī)格：HPLC>98%,標準品血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa試劑盒柚皮;Naringin

大腸埃希氏菌Escherichia│coli 質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR血小板激活因子乙酰解2，質(zhì)試劑盒延胡索乙;Tetrahydropalm
細胞固定/破膜試劑盒臭曲霉 2,3,6-三氟芐生物羧化

熱帶假絲酵母 2-溴-3-羥基-6-音猬因子

微紅微球?qū)?/span> 4-甲氧基-2-硝基-苯甲蓋他病

白僵 1-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉Salusinβ蛋白

地衣芽孢桿 6-硝基-1,2-苯并異噻唑啉-3-酮 1,1-二氧化物可溶性因子受體

阿舒假囊酵母 N-乙?；?3-甲β微球蛋白

米曲霉 4-三糖類抗原50

泡盛曲霉變種 5-硝基噻吩-2-羧糖類抗原199

植物乳桿 3-芐氧基苯甲酰肼糖類抗原153

核盤硅化鎂糖類抗原242

溶血不動桿順-6-壬烯糖類抗原724

短穩(wěn)桿 1-環(huán)戊烯基乙prestin 蛋白

異常漢遜酵母 2,3-二氫苯并呋喃-5-番茄紅

枯草芽孢桿 4-溴-2-羥基甲酯色P45011B1

黑根霉 6-溴-1,2,3,4-四氫異喹啉色P45011B2
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)