測(cè)定意義

NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中，特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號(hào)傳遞的作用，是一種新型的生物信使分子，在機(jī)體的生理、病理過(guò)程中起著重要的作用。

測(cè)定原理：

NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成NO2—，在酸性條件下，NO2—與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測(cè)定其吸光值，可以計(jì)算NO含量。為了排除樣品色素等的影響，每個(gè)樣品需做對(duì)照管。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽或勻漿器、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、1 mL玻璃比色皿/96孔板、蒸餾水。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過(guò)高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)允瓜♂尯蟮臉悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.        加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.        棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100μl（在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘。

3.        溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.        每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液） 100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。

5.        溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.        依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.       依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.       用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進(jìn)行檢測(cè)。

1、細(xì)胞或組織樣品的制備：

培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。