TRzol LS（液體樣本 RNA 提取試劑）

商品屬性：

商品介紹：

保存條件：-20℃保存

產(chǎn)品介紹：
利用痘苗病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將PCR產(chǎn)物定 向克隆到線性化的pBM30原核表達載體中。適用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion 和Q5等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產(chǎn)物。引物T7和T7t可用于菌落PCR和測序 鑒定。 
產(chǎn)品特點：
（2）只適合平末端 PCR 產(chǎn)物的快速、高效、定向克隆。 （6）載體具有卡那霉和新霉抗性。
（1） 連接反應(yīng)僅需 5 分鐘
（2） 只適合平末端PCR 產(chǎn)物的快速、高效、定向克隆。
（3） 載體采用了新的制備工藝，零背景，無需藍(lán)白斑篩選。
（4） 具有T7 啟動子，類似于 pET30 載體，具備原核表達所需的所有調(diào)控元件。適用
于外源基因在大腸桿菌中的高水平表達。
（5） 帶 His.tag 和 S.tag 兩種純化標(biāo)簽。
（6） 具有凝血和腸激酶兩種蛋白酶酶切識別序列。
（7） 載體具有卡那霉抗性。
注意事項：
（1）引物要求：PCR 引物 5’端不能進行磷酸化修飾，普通商業(yè)化引物即可。上游引 物的 5’端添加 CACC 四個堿基。如果表達蛋白需 C 端帶 6His 標(biāo)簽，下游引物則需 要去掉基因本身的終止密碼子（3 個堿基）。目的蛋白的翻譯終止由 6His 標(biāo)簽的終 止密碼子TGA 來實現(xiàn)。
（2）DNA 聚合酶：選用 Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和 Xerox 等高保真 DNA 聚合酶用于 PCR 擴增。
（3）連接時間：5-15 分鐘，通常用 15 分鐘。
（4）連接溫度：室溫 (22℃-30℃)，可使用 PCR 儀控溫。最佳反應(yīng)溫度為 25℃。若片段存在高 GC 等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，可在 37℃反應(yīng)。

（5）產(chǎn)物要求：為保證 PCR 產(chǎn)物完整，建議 72℃后延伸 5-10 分鐘。連接前使用瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物的質(zhì)量和純度，如 PCR 產(chǎn)物為非單一性條帶，目的片段一定要切膠回收。如 PCR 產(chǎn)物為單一條帶，無引物二聚體，可取 1-3?l 的 PCR 產(chǎn)物直接連接。但若擴增模板為質(zhì)粒 DNA，應(yīng)注意質(zhì)粒的抗性。由于 pBM40 載體為卡那抗性，以氨芐抗性的模板質(zhì)粒擴增的 PCR 產(chǎn)物直接連接后的產(chǎn)物可涂布在卡那抗性的 LB 平板上。以卡那抗性的模板質(zhì)粒擴增的 PCR 產(chǎn)物應(yīng)切膠回收后再連接。
（6） 片段用量：膠回收的 DNA 片段一般使用量為 50-100ng。對照片段為 5’端帶CACC四個堿基的全長 EGFP 基因的平末端產(chǎn)物，表達產(chǎn)物大小為 32.6kD。
（7） 往 T7 和 T7t 引物干粉管加 100?l 滅菌水即為 5?M 濃度的引物。
操作步驟：
1.連接反應(yīng)
按下表，在一個 0.2ml PCR 管中依次加入

加完試劑后，輕輕混勻低速離心，使溶液集中在管 底。PCR 儀控溫 25℃反應(yīng) 15 分鐘，反應(yīng)結(jié)束后， 將離心管置于冰上，等待細(xì)菌轉(zhuǎn)化。如暫時不轉(zhuǎn)化， 可凍存于-20℃。

2. 轉(zhuǎn)化
（1）取 5µl 連接產(chǎn)物到 100µl 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴 20-30 分鐘。
（2）42℃水浴中熱擊 30 秒鐘。
（3）立刻置于冰水浴中 2 分鐘。
（4）加入 900µl 無菌的不含抗生素的 SOC 或 LB，37℃，200rpm 振蕩培養(yǎng) 60 分鐘。
（5）4000rpm 離心 1 分鐘，去掉部分上清，保留 100µl 用移液器輕吹菌體，充分懸浮菌液，取全部菌液涂布，然后 37℃培養(yǎng)過夜（12-16 小時）。
3. 陽性克隆鑒定：
（1）菌落PCR方法鑒定陽性克隆
A.用10?l吸頭挑選克隆至預(yù)先加有10μl無菌水或LB培養(yǎng)基的PCR管中，吹打混合。
B.在25? l PCR反應(yīng)體系中加入2μl細(xì)菌懸液為模板、5μM濃度的CMVPfor和SV40PolyArev各1μl，PCR方法鑒定陽性克隆。B.在25?l PCR反應(yīng)體系中加入2μl細(xì)菌懸液為模板、T7和T7t各1μl，PCR方法鑒定陽性克隆。
C.PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5分鐘（裂解細(xì)胞，失活核酸酶），94℃變性10 秒鐘，55℃退火10秒鐘（注：使用基因特異性引物做PCR鑒定時，退火溫度則需按其最適溫度進行調(diào)整），72℃延伸（ 根據(jù)片段的大小決定延伸時間，通常每1-2分/1kb），30-35個循環(huán)，72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果，有強烈的明顯條帶的克隆為重組體，與插入片段大小相近（由于擴增引物在克隆位置的兩側(cè)，所以PCR擴增出的DNA的長度比插入片段大349bp）可視為陽性克隆。菌落PCR方法鑒定重組體時一定要設(shè)立一個不加菌液的陰性對照。
（2） 限制性酶切分析陽性克隆
pBM30為低拷貝質(zhì)粒。挑取單菌落接種于8mL含卡那的LB培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)，小量制備質(zhì)粒，參考pBM30圖譜，選擇合適的限制性內(nèi)切酶（NdeI，Bgl II，Kpn I，NcoI，Xho I），酶切后電泳鑒定重組質(zhì)粒。
（3） 測序：用T7和T7t對質(zhì)粒進行測序分析。

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