pCold-SUMO-10His原核蛋白表達(dá)試劑盒

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描述：本試劑盒所包含的原核表達(dá)載體(pCold-SUMO-10His)是在 pCold-SUMO 載體基礎(chǔ)上改造而成，

該載體啟動(dòng)子(CS Promoter)來(lái)源于南極嗜冷細(xì)菌，在低溫下(15 度)才能啟動(dòng)蛋白的表達(dá)。低溫下細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，使得蛋白合成速度減慢，從而最大限度的提高了蛋白正確折疊的幾率，提高了蛋白可溶性表達(dá)，增強(qiáng)了活性蛋白的表達(dá)比率。該表達(dá)系統(tǒng)所包含的 SUMO tag 可以極大地提高小分子量蛋白的表達(dá)量，而且進(jìn)一步提高了蛋白的可溶表達(dá)幾率。同時(shí)，TEE 信號(hào)肽可增強(qiáng)冷啟動(dòng)子調(diào)控下目的蛋白的高表達(dá)。
改進(jìn)后的 pCold-SUMO-10His 載體，其 SUMO 蛋白標(biāo)簽含有 10 個(gè)組氨標(biāo)簽（10His tag），使其結(jié)合 Ni-NTA 的能力更強(qiáng)。與較早版本的 pCold-SUMO 表達(dá)系統(tǒng)相比，pCold-SUMO-10His 表達(dá)系統(tǒng)在保留了原有統(tǒng)的蛋白可溶性能生產(chǎn)能力、高特異性剪切能力的情況下，對(duì) Ni-NTA 結(jié)合能力的得到明顯提高。其對(duì) Ni-NTA 結(jié)合能力的提高，

在以下三個(gè)方面改善了生產(chǎn)重組蛋白的性能：

（1）提高了粗蛋白樣品中目標(biāo)蛋白的捕獲能力，從而提高純化產(chǎn)量；

（2）在蛋白純化過(guò)程中可以
使用更高濃度的咪唑進(jìn)行漂洗，去雜蛋白的能力明顯提升，從而獲得更高純度的重組蛋白；

（3）在重組蛋白酶切去除 SUMO標(biāo)簽后，利用 Ni-NTA 去除 SUMO 標(biāo)簽更為，獲得純度更高的無(wú)標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)蛋白。
關(guān)于宿主菌的使用：本試劑盒配備了兩種宿主表達(dá)菌感受態(tài)細(xì)胞，Lyophilized Arctic (DE3)感受態(tài)和 LyophilizedBL21(DE3) Chaprone 感受態(tài)，兩種感受態(tài)均為凍干品形式可長(zhǎng)期保存在-20℃，效價(jià)無(wú)明顯下降（2~10X10e5 cfu/μg）。
通常在質(zhì)粒載體的構(gòu)建完成，并測(cè)序驗(yàn)證后，可將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入該感受態(tài)進(jìn)行蛋白表達(dá)。該宿主菌僅為蛋白表達(dá)生產(chǎn)用，不可以進(jìn)行載體構(gòu)建和質(zhì)粒的提取制備。由于 pCold-SUMO 系統(tǒng)的高可溶性表達(dá)特性，在大多數(shù)情況下重組蛋白在 LyophilizedArctic (DE3)感受態(tài)即可獲得理想的可溶表達(dá)，因此實(shí)驗(yàn)請(qǐng)選用 Lyophilized Arctic (DE3)感受態(tài)宿主菌。

在 LyophilizedArctic (DE3)感受態(tài)宿主菌可溶表達(dá)效果不理想的情況下，再選用操作相對(duì)復(fù)雜的、帶有輔助折疊伴侶分子的 LyophilizedBL21(DE3)Chaprone 宿主菌，該系統(tǒng)可獲得最佳的可溶表達(dá)。除此外，pCold-SUMO 系統(tǒng)在常規(guī) BL21(DE3)、BL21(DE3)plys等宿主菌內(nèi)均可獲得可觀的可溶性表達(dá)。
關(guān)于蛋白酶的使用：試劑盒配備了 SUMO 蛋白酶（酵母來(lái)源，也稱為 UIP 蛋白酶）和 rTEV 蛋白酶，在第一步載體構(gòu)建過(guò)程中需要評(píng)估、考慮兩個(gè)蛋白酶的使用策略。SUMO 蛋白酶識(shí)別蛋白結(jié)構(gòu)，切割活性高、酶切，對(duì)于需要去除 Tag的重組蛋白其是。個(gè)別情況下 SUMO 標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)會(huì)受到 C 端重組目標(biāo)蛋白的影響，使得 SUMO 蛋白酶對(duì)重組融合蛋白的切割效率降低、甚至是無(wú)效，此時(shí)再選用 rTEV 蛋白酶進(jìn)行酶切。由于 rTEV 蛋白酶識(shí)別氨基酸序列，個(gè)別重組融合蛋白會(huì)包埋識(shí)別序列，因此也會(huì)導(dǎo)致蛋白酶切效率下降。由于重組融合蛋白結(jié)構(gòu)的無(wú)法預(yù)測(cè)性，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中兩種蛋白酶的酶切均需要測(cè)試。無(wú)論如何，通常 SUMO 蛋白酶具有更高的效率。本試劑盒配備的 SUMO 蛋白酶可以識(shí)別 SUMO標(biāo)簽結(jié)構(gòu)（SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG）切割位點(diǎn)位于 QIGG 之后。SUMO 蛋白酶含有雙 His 標(biāo)簽，保證了 SUMO 蛋白酶高親力的結(jié)合 Ni-NTA，以最大限度的去除 SUMO 蛋白酶（分子量約 26kD）。rTEV 蛋白酶可以識(shí)別 SUMO 標(biāo)簽后面的 Glu-AsnLeu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)氨基酸序列，并在識(shí)別位點(diǎn) Gln-Gly(QG)之間進(jìn)行切割，從而去除 SUMO 標(biāo)簽。rTEV 蛋白酶含有 6XHis 標(biāo)簽（分子量約 30kD），可使用 Ni-NTA 純化介質(zhì)去除。
本試劑盒配備的 pCold-SUMO-10His-Positive Plasmid 為蛋白表達(dá)陽(yáng)性質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有 43kD 的目標(biāo)蛋白，其與SUMO 標(biāo)簽（19kD）融合后分子量約為 62kD。該表達(dá)質(zhì)粒在 Arctic (DE3)中即可獲得良好的表達(dá)。其可以僅可做為表達(dá)、酶切實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照品。

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