細(xì)胞培養(yǎng)步驟:

一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:

1) 準(zhǔn)備DMEM-H培養(yǎng)基(DMEM-H:GIBCO,貨號(hào)12800017, 添加NaHCO3 1.5g/L),90%;胎牛血清,10%。

2) 培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3) 凍存液:90%*培養(yǎng)基,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。

二. 細(xì)胞處理:

1) 復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中,加入約8ml培養(yǎng)基,培養(yǎng)過(guò)夜)。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2) 細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

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商品屬性：

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號(hào)21875-091)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

操作要點(diǎn)：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無(wú)菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細(xì)胞能盡快通過(guò)最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒(méi)入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

人 EGFR 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶HA標(biāo)簽

人 EGFR 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽

人 EGFR 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶His標(biāo)簽

人 EGFR 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽

人 CD180 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶His標(biāo)簽

人 TLR6 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽

人 CD30 / TNFRSF8 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽

人 Smad3 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體),

NCI-H1975 (肺腺癌細(xì)胞) 50mL Potassium Chloride Solution（溶液）,1M   Potassium Chloride Solution,1M   常溫保存

2 ug pMito-iRFP pMito-iRFP 低溫運(yùn)輸，-20℃保存 78-5000 pg/mL ELISA Kit for Prostaglandin D2

明膠鹽緩沖液  250g 78-5000 pg/mL ELISA Kit for Human Putative RNA-binding protein 3

100mL GAL指示劑培養(yǎng)基 GAL Indicator Medium  常溫

2 ug pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 低溫運(yùn)輸，-20℃保存 0.312-20 ng/mL ELISA Kit for Human Protein Wnt-4

2 ug pLVX-DsRed-Monomer-C1 pLVX-DsRed-Monomer-C1 低溫運(yùn)輸，-20℃保存 31.2-2000 pg/mL ELISA Kit for Human Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9

2 ug pLX304 pLX304 低溫運(yùn)輸，-20℃保存 0.156-10 ng/mL 人谷草酰乙酸轉(zhuǎn)氨1樣蛋白1(GOT1L1)ELISA試劑盒

2 ug pGCsi/H1/Neo/GFP Survivin pGCsi/H1/Neo/GFP Survivin 低溫運(yùn)輸，-20℃保存 0.156-10 ng/mL ELISA Kit for Human Heparin cofactor 2

1個(gè) 15mLDNA超濾離心管(9-15KD)  

50次 柱式軟體動(dòng)物DNAout Column Mollusk DNAOUT 常溫 0.39-25 ng/mL 前列腺素F2alpha (Prostaglandin F2alpha)ELISA試劑盒

V-P試劑盒  5ml*4 0.312-20 ng/mL ELISA Kit for Human Laminin subunit beta-1