細胞培養(yǎng)步驟:

一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備:

1) 準備DMEM-H培養(yǎng)基(DMEM-H:GIBCO,貨號12800017, 添加NaHCO3 1.5g/L),90%;胎牛血清,10%。

2) 培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3) 凍存液:90%*培養(yǎng)基,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

二. 細胞處理:

1) 復蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或將細胞懸液加入10cm皿中,加入約8ml培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜)。第二天換液并檢查細胞密度。

2) 細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng)。

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商品屬性：

細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；優(yōu)質胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

操作要點：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內，再逐步轉移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內*解凍，使細胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內，將管內細胞轉移至準備好的離心管內，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉移至離心管內。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

5）將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內培養(yǎng)。

6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。

人 CTNNB1 基因全長ORF克隆 (表達載體), 帶FLAG標簽

人 CTNNB1 基因全長ORF克隆 (表達載體), 帶HA標簽

人 KRAS 基因全長ORF克隆 (表達載體), 帶FLAG標簽

人 IL17A 基因全長ORF克隆 (表達載體), 帶His標簽

人 CD45 轉錄變體2 基因全長ORF克隆 (表達載體), 帶His標簽

人 CD137 / 4-1BB / TNFRSF9 基因全長ORF克隆 (表達載體), 帶FLAG標簽

人 CD137 / 4-1BB / TNFRSF9 基因全長O

SVEC4-10 (小鼠淋巴結內皮細胞)250mL Potassium Acetate Solution(乙酸鉀溶液），20%   Potassium Acetate Solution，20%   常溫保存 0.156-10 ng/mL 人N糖基化/DNA裂解(OGG1)ELISA試劑盒

卵黃瓊脂培養(yǎng)基基礎 Egg Yolk Agar Base 250g 0.312-20 ng/mL 人沉默調節(jié)蛋白2(SIRT2)ELISA試劑盒

750U 核酸外切 I Exonuclease I  -20℃保存 78-5000 pg/mL 人跨膜受體蛋白(NOTCH1)ELISA試劑盒

50次 TRIzol伴侶 TRIzol-Mate 常溫

1瓶 NIH:OVCAR-3株 NIH:OVCAR-3 低溫運輸和保存四號瓊脂基礎      進口、國產4 Agar Base用于霍亂弧菌選擇性分離培養(yǎng)，滅菌冷至50℃加入亞碲酸鉀，倒平板250

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2 ug pLVX-tdTomato-C1 pLVX-tdTomato-C1 低溫運輸，-20℃保存 0.312-20 ng/mL 人受磷蛋白(PLN)ELISA試劑盒

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50T 魚PCR檢測試劑盒   低溫運輸，-20℃保存M肉湯進口、國產M-Broth250克牛奶和乳制品中乳酸菌檢測和增菌培養(yǎng)

2 ug YEP365 YEP365 低溫運輸，-20℃保存 0.156-10 ng/mL 人CD30配體(CD30L)ELISA試劑盒

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