細(xì)胞培養(yǎng)步驟:

一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:

1) 準(zhǔn)備DMEM-H培養(yǎng)基(DMEM-H:GIBCO,貨號(hào)12800017, 添加NaHCO3 1.5g/L),90%;胎牛血清,10%。

2) 培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3) 凍存液:90%*培養(yǎng)基,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。

二. 細(xì)胞處理:

1) 復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中,加入約8ml培養(yǎng)基,培養(yǎng)過(guò)夜)。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2) 細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

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商品屬性：

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號(hào)21875-091)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

操作要點(diǎn)：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無(wú)菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細(xì)胞能盡快通過(guò)最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒(méi)入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

大鼠 RBP4 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

大鼠 PVR / CD155 / NECL5 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

食蟹猴 Thrombopoietin / THPO / TPO 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

人 Decorin / DCN / SLRR1B 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

小鼠 CADM3 / IGSF4B / NECL1 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

小鼠 KNG1 / BDK / kininogen-1 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

Renca (RenCa) (小鼠腎癌細(xì)胞) 2 ug pcDNA6/TR pcDNA6/TR 低溫運(yùn)輸，-20℃保存 7.8-500 ng/mL ELISA Kit for Human Cytochrome P450 2C19

2 ug pFAST II pFAST II 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

DTM添加劑2  1ml*5 0.78-50 ng/mL 人原C(PG-C)ELISA試劑盒

乳糖發(fā)酵管（軍團(tuán)菌）  20支 78-5000 pg/mL 人黑色素瘤抗原T1( MART-1)ELISA試劑盒

5mL 心肌生長(zhǎng)因子 Growth Factor For Cell Culture -20℃保存 78-5000 pg/ml ELISA Kit for Human Stromelysin-2

1瓶 MEG-01株 MEG-01 低溫運(yùn)輸和保存

乳酸棉藍(lán)染色液  5ml*8 0.156-10 ng/mL 人肝配蛋白A受體3(EPHA3)ELISA試劑盒

5次 96孔板血液DNAout（真空法） 96 Microwell Plate Blood DNAOUT 常溫

1瓶 Hep 3B2.1-7株 Hep 3B2.1-7 低溫運(yùn)輸和保存 0.312-20 ng/mL 人蛋白Wnt-7b(Protein Wnt-7b)ELISA試劑盒

100mL Bis-Tris Buffer,0.2M,pH6.5   Bis-Tris Buffer,0.2M,pH6.5   常溫保存麥芽汁培養(yǎng)基進(jìn)口、國(guó)產(chǎn)Malt Extract Agar250克用于啤酒酵母等真菌分離傳代

50次 T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 T7 in vitro Transcription Kit -20℃保存 0.312-20 ng/mL 人低密度脂蛋白受體關(guān)聯(lián)蛋白4(LRP-4)ELISA試劑盒