逆轉(zhuǎn)錄是指以 RNA 為模板,合成與其互補的 cDNA 的過程。逆轉(zhuǎn)錄 PCR 是將 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription)和 cDNA 的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)相結(jié)合的技術(shù),故逆轉(zhuǎn)錄稱為 RT-PCR 或反轉(zhuǎn)錄 PCR。逆轉(zhuǎn)錄酶是存在于 RNA 病毒體內(nèi)的依賴 RNA 的 DNA 聚合酶。RT-PCR 實驗中的逆轉(zhuǎn)錄酶需要具有以下三種活性
1. 依賴 RNA 的 DNA 聚合酶活性:以 RNA 為模板合成 cDNA 的第一條鏈;
2. Rnase 水解活性:水解 Rnase 雜合體中的 RNA;
3. 依賴 DNA 的 DNA 聚合酶活性:以一條 DNA 鏈為模板合成互補的雙鏈 DNA
在選擇逆轉(zhuǎn)錄酶時,建議選擇無 RNaseH①活性(RNaseH-)的逆轉(zhuǎn)錄酶。具有 RNaseH 活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNaseH 活性會與聚合酶活性競爭 RNA 模板與 DNA 引物(或 cDNA 延伸鏈)形成的雜合鏈,并降解雜合鏈中的 RNA 鏈。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作為合成 cDNA 的有效底物,降低了 cDNA 合成的產(chǎn)量與長度。
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