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標記熒光抗體常用Marsshall法方法及步驟

時間:2022/5/23閱讀:239
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標記熒光抗體常用Marsshall法方法及步驟:

一、材料

抗體球蛋白溶液、0.5mol/L(pH9.0)碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol/LPBS等。


二 、方法及步驟

抗體的準備

取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中,再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,使最后免疫球蛋白濃度為20mg/ml,碳酸鹽緩沖液容量為總量的1/10,混勻,將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當以不起泡沫為宜)5~10min。

熒光素的準備

根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量,按每毫克免疫球蛋白加0.01mg熒光色素,用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計算出免疫球蛋白、熒光素的量,還可以算出需加緩沖液的量。
1.蛋白溶液:含量Amg/m1;容積Bml。
2.總蛋白量(AXB)=Crag。
3.C/20~C/10=Dmg(如蛋白含量低于20mg/ml,用C/10;如高于20mg/ml,用C/20)。
4.熒光素FITC的量:(1/50~2/100)XC=Emg。
5.巳0.5mol/L(pH9.5)碳酸鹽緩沖液D/10=Fml。
6. PBS量D-(B+F)=Gml。

注:A為蛋白含量,mg/ml;B為蛋白質(zhì)溶液的容積;C為蛋白總量,mg;D為常數(shù),mg;正為熒光素的量,mg;F為碳酸鹽緩沖液的容積,ml;G為PBS的容積,ml。

③結(jié)合(或標記) 邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在5—10min內(nèi)加完),加完后,繼續(xù)避光攪拌12h左右。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。

④透析 結(jié)合完畢后,將標記的球蛋白溶液離心(2500r/min)20rain,除去其中少量的沉淀物,裝入透析袋中,再置于燒杯中,用pH8.0緩沖鹽水透析(0~4~C)過夜。

⑤過柱 取透析過夜的標記物,通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱,分離游離熒光素,收集標記的熒光抗體進行鑒定。洗脫液:0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2);過濾量:12ml標記全球蛋白液(過濾前未透析);收集量:20ml(稀釋1.7倍左右)。



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