【儀表網 研發(fā)快訊】近日，北理工霍毅欣課題組在1區(qū)TOP期刊《Advanced Science》發(fā)表題為“Customization of Ethylene Glycol (EG)-Induced BmoR-Based Biosensor for the Directed Evolution of PET Degrading Enzymes”的研究文章。文章為PET降解酶的定向進化提供了基于BmoR生物傳感器可視化高通量篩選工具，加快了酶元件“設計-構建-測試-學習”循環(huán)，對塑料廢棄物的生物降解及回收利用具有重要意義。該工作以北京理工大學為第一通訊單位，碩士生李敏和陳振婭研究員為共同第一作者，陳振婭研究員和霍毅欣教授為共同通訊作者，山東大學祁慶生教授為共同作者。
 

　　來源于假單胞菌 (Pseudomonas butanovora) 的BmoR是一種σ54依賴型轉錄激活子，屬于細菌增強子結合蛋白的成員。BmoR在正烷烴代謝途徑中被發(fā)現(xiàn)和表征，可以識別并結合C2-C7的醇分子并增強下游基因的轉錄。本課題組已經在大腸桿菌中構建基于BmoR的生物傳感器系統(tǒng)用于異丁醇高產菌株的高通量篩選，以及高效細胞工廠的動態(tài)調控。PET在塑料降解酶的生物降解作用下，水解產生中間體MHET，繼續(xù)被水解產生乙二醇。乙二醇 (Ethylene glycol, EG) 和對苯二甲酸 (Terephthalic acid, TPA) 是組成PET高聚體的基本單元。EG作為一種潛在配體分子，有潛力活化BmoR并激活下游報告基因的轉錄。選擇熒光蛋白作為報告蛋白，論文開發(fā)了一種基于BmoR傳感系統(tǒng)的可視化高通量篩選體系(圖1)，為PET降解酶的定向進化提供寶貴工具。
 

圖1 FACS協(xié)助的EG特異性響應BmoR突變體的篩選流程
 

　　塑料污染是當今環(huán)境面臨的嚴重問題之一，開發(fā)具有高效降解能力的塑料降解酶可以為相關產業(yè)帶來新的商機和發(fā)展機會。蛋白質的定向進化是一種利用分子生物學和進化算法相結合的技術，用于改變蛋白質的性質或功能，不需要對蛋白質的結構和功能之間的關系有深度理解。定向進化在較短的時間內能得到基因多樣性的大量突變體文庫，增加了篩選的廣度和多樣性，加速了酶改造升級的進程。通過定向進化的方法優(yōu)化塑料降解酶的活性和特異性，可以提高塑料廢物的回收和再利用效率。這有助于減少對新原料的需求，降低生產成本，推動可持續(xù)資源利用。然而，定向進化的瓶頸在于高通量篩選工具的開發(fā)。
 

　　TFB將基因型和表型耦連，能夠將分子的濃度信號轉化為可視化的光信號，允許研究者用酶標儀代替吞吐量低、成本高的液相、氣相色譜技術。在單基因層面，TFBs可以對構建的不同尺度的基因文庫進行篩選或挖掘，加快了酶元件改造和開發(fā)的進程。在基因組層面，TFB可以從大型菌株突變庫中識別出具有所需表型或可高產出目標化合物的微生物菌株個體，加快了菌株選育的進程，以實現(xiàn)生物制造行業(yè)的有利可圖的生物過程。BmoR是一種可受醇調節(jié)的轉錄因子，并調節(jié)Pbmo啟動子驅動下游基因的表達。選擇熒光蛋白作為報告信號置于啟動子Pbmo下游，通過醇分子調節(jié)BmoR進而表達報告基因，可以將BmoR開發(fā)為可視化高通量篩選工具。論文利用已經定制的具有高動態(tài)范圍、高靈敏度的EG響應型BmoRN207S傳感系統(tǒng)，對以SUMO-MHETase-FASTase融合表達形式構建了MHETase隨機突變文庫。將傳感系統(tǒng)和降解系統(tǒng)耦連，用于MHETase的定向進化，以提高催化活性(圖2)。
 

圖2 利用生物傳感器篩選的高活性MHETase突變體
 

　　此項工作得到國家自然科學基金委國際合作項目“塑料解聚及資源化微生物菌群的人工構建”及面上項目、河北省自然科學基金委和唐山市科技計劃項目的資助，以及北京理工大學生物與醫(yī)學工程公共實驗中心的支持。
 

　　北理工課題組在BmoR生物傳感元件的改造與應用已發(fā)表多篇高水平文章，例如Advanced Science, 2024, 11: 23；Acs Sensors, 2024, 9:5002-5024; Chemical Engineering Journal, 2024, 491: 152076；Microbial Cell Factories, 2019, 18: 30；Metabolic Engineering, 2019, 56: 28-38；ACS Synthetic Biology, 2022, 11: 1251-1260。