【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】2024年11月22日，《Nature Methods》期刊在線發(fā)表了題為《Super-resolution imaging of fast morphological dynamics of neurons in behaving animals》的研究論文。該研究由中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心(神經(jīng)科學研究所)王凱研究組完成。研究團隊開發(fā)了一種新型超分辨顯微成像技術(shù)，有效解決了背景噪聲干擾和運動偽影兩大技術(shù)難題，可在清醒動物腦中對神經(jīng)元的快速動態(tài)進行超分辨率光學成像和解析，為研究動物學習過程中的神經(jīng)元突觸可塑性基礎(chǔ)提供了有力的新工具。
 

　　理解微觀生命過程如何有機構(gòu)成宏觀生命體，并實現(xiàn)復(fù)雜的生理功能，是生命科學的重要研究內(nèi)容。然而，受限于研究技術(shù)手段，微觀動態(tài)的研究通常需要在簡化的離體實驗中開展，使其難以與宏觀生命現(xiàn)象如動物的睡眠和學習行為等直接建立聯(lián)系。在神經(jīng)科學研究中，解析突觸的形態(tài)和功能可塑性是探究學習記憶底層機理，進而理解大腦工作原理的重要基礎(chǔ)。神經(jīng)元突觸是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。在學習記憶等過程中，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接權(quán)重的改變和突觸形態(tài)的變化高度相關(guān)。使用活體動物雙光子顯微成像技術(shù)捕捉突觸在學習記憶、睡眠和疾病等過程中的形成和消亡，極大提升了對神經(jīng)元形態(tài)可塑性和腦功能之間聯(lián)系的認識。然而，受限于光學衍射效應(yīng)，傳統(tǒng)光學顯微鏡，包括雙光子顯微鏡，無法突破200~300納米的分辨率極限，難以進一步觀察研究更精細的結(jié)構(gòu)和動態(tài)。近年來，新發(fā)展的超分辨光學顯微成像技術(shù)可突破光學衍射極限，并已經(jīng)為突觸研究帶來了一場技術(shù)革命。然而，由于面臨多項技術(shù)難點，目前超分辨率熒光顯微鏡多應(yīng)用于離體的細胞和腦片研究，尚未有技術(shù)能夠在清醒動物中超分辨解析正常生理和行為狀態(tài)下突觸的結(jié)構(gòu)和功能。因此，開發(fā)能夠應(yīng)用于清醒動物的超分辨光學成像新技術(shù)一直是神經(jīng)科學和光學成像技術(shù)領(lǐng)域的長期愿景和技術(shù)前沿。
 

　　發(fā)展可應(yīng)用于清醒動物的超分辨成像技術(shù)面臨兩個主要的技術(shù)難題，背景噪聲干擾和運動偽影。單分子定位(PALM\STORM)和結(jié)構(gòu)光照明(SIM)超分辨成像技術(shù)基于寬場成像，受背景噪聲干擾嚴重。同時，這些技術(shù)需要樣品在保持靜止的狀態(tài)下采集多張圖片來重構(gòu)一張超分辨圖片，難以容忍動物呼吸和心跳造成的微小移動。受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)基于點掃描成像，可通過共聚焦機制濾除背景噪聲干擾，但其需要較長的信號積累時間，受運動偽影干擾嚴重，只嘗試在麻醉動物中開展小視場成像。為了同時解決這些技術(shù)難題，研究團隊創(chuàng)新提出了多模式復(fù)用結(jié)構(gòu)光線照明超分辨顯微成像技術(shù)(MLS-SIM)。該技術(shù)的關(guān)鍵創(chuàng)新在于提出了在單次線掃描成像過程中，通過快速切換不同的線照明模式來分別獲得三個方向上的超分辨信息，并提出新的超分辨重構(gòu)理論框架，實現(xiàn)準確高效的超分辨圖像重構(gòu)。在線性熒光激發(fā)模式下，MLS-SIM可以150納米橫向分辨率對清醒小鼠皮層中神經(jīng)元樹突棘尖刺和軸突終扣微觀動態(tài)開展長達上千幀的連續(xù)成像，速度達每秒數(shù)幀，可容忍每秒50微米的樣品運動而不影響其超分辨成像性能。進一步，利用皮秒脈沖激光實現(xiàn)非線性熒光激發(fā)，非線性MLS-SIM可以將橫向分辨率提高至約100納米，且保持同樣的樣品運動容忍度。
 

　　多模式復(fù)用結(jié)構(gòu)光線照明超分辨顯微成像技術(shù)填補了超分辨顯微鏡在清醒動物上開展成像的空白，并彌補了以往技術(shù)在活體動物成像時長和光漂白特性上的不足，為在體微觀研究提供了廣闊的前景。利用該技術(shù)，研究團隊在清醒的小鼠大腦中驗證了神經(jīng)元樹突棘和軸突終扣上存在著快速變化的尖刺動態(tài)，并量化研究了清醒-睡眠循環(huán)中神經(jīng)元的微觀快速動態(tài)的改變。該技術(shù)還實現(xiàn)了雙色超分辨同時成像，探究了PSD-95蛋白聚團的微觀結(jié)構(gòu)與樹突棘發(fā)生之間的聯(lián)系。在雙色成像實驗中，研究團隊發(fā)現(xiàn)了樹突主干上存在許多動態(tài)的小突起，這種突起結(jié)構(gòu)的尺寸大多小于傳統(tǒng)雙光子成像技術(shù)的解析能力，只能通過超分辨成像進行動態(tài)分析。動態(tài)觀察顯示，樹突主干上的PSD-95聚團附近存在著頻繁的小突起生成現(xiàn)象。通過對一段時間內(nèi)的動態(tài)進行統(tǒng)計分析，研究團隊發(fā)現(xiàn)樹突主干上的PSD-95聚團和主干上的小突起存在著顯著的共定位現(xiàn)象。這一新發(fā)現(xiàn)的小突起結(jié)構(gòu)及其與PSD-95的共定位可能暗含樹突棘發(fā)生的細胞機制，為未來的突觸可塑性研究提供了新的證據(jù)。
 

　　總結(jié)而言，該研究開發(fā)了一種新型超分辨成像技術(shù)，同時解決了背景噪聲干擾和運動偽影兩大技術(shù)難題，填補了在清醒動物中開展超分辨成像的技術(shù)空白。該技術(shù)的出現(xiàn)使得在清醒動物生理狀態(tài)下對神經(jīng)元及其他細胞的亞細胞微觀動態(tài)進行長時間、大范圍的成像和分析成為可能。這一關(guān)鍵技術(shù)進步為超分辨成像在神經(jīng)科學領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為神經(jīng)科學研究提供了新的有力工具。
 

　　中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心(神經(jīng)科學研究所)的博士畢業(yè)生張宇杰為該研究的第一作者，白璐，王鑫，趙鈺琛，張?zhí)锢俸腿~立晨參與了課題的研究，腦智卓越中心張哲研究員、杜旭飛博士和杜久林研究員參與指導(dǎo)了該項工作，王凱研究員為本論文的通訊作者。這項研究得到了科技部、國家自然科學基金委、上海市及中國博士后科學基金的經(jīng)費資助。
 

　　多模式復(fù)用結(jié)構(gòu)光線照明超分辨顯微成像技術(shù)MLS-SIM應(yīng)用于清醒小鼠皮層超分辨成像

 

　　圖注(a)MLS-SIM照明范式示意圖。(b)清醒小鼠腦皮層神經(jīng)元形態(tài)的超分辨成像結(jié)果。LC：線共聚焦成像；LCDeconv：經(jīng)過反卷積處理的線共聚焦成像；MLS-SIM：超分辨成像。標尺，5微米。(c)小鼠腦皮層不同深度成像的結(jié)果。標尺，2微米。(d)超分辨觀察到樹突棘尖刺的快速和長時程動態(tài)。標尺，1微米。(e)雙色成像樹突棘形態(tài)和PSD-95蛋白。紫色：膜標記mRuby；綠色：EGFP標記的PSD-95。標尺，500納米。