【儀表網(wǎng) 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)】根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)、民政部印發(fā)的《團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理規(guī)定》及《中國(guó)計(jì)量測(cè)試學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》有關(guān)規(guī)定，經(jīng)中國(guó)計(jì)量測(cè)試學(xué)會(huì)批準(zhǔn)立項(xiàng)，由青島星賽生物科技有限公司等單位牽頭起草的《益生菌活菌計(jì)數(shù)及代謝活力檢測(cè)拉曼光譜法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)已完成征求意見(jiàn)稿的編制，為保證標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性、嚴(yán)謹(jǐn)性和適用性，現(xiàn)面向社會(huì)廣泛公開(kāi)征求意見(jiàn)。意見(jiàn)反饋郵箱：zhoupin@singlecellbiotech.com。
 

　　2001 年聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)提出，當(dāng)攝入足夠數(shù)量時(shí)，對(duì)宿主產(chǎn)生健康益處的活性微生物稱之為益生菌。國(guó)際益生菌和益生元科學(xué)協(xié)會(huì)(ISAPP)2021 年對(duì)發(fā)酵食品定義為：通過(guò)所需的微生物生長(zhǎng)和食品成分的酶轉(zhuǎn)化而制成的食品。其中特別指出，當(dāng)發(fā)酵食品中含有確切的活益生菌時(shí)，才能標(biāo)注“含有益生菌”，并認(rèn)為改善食品營(yíng)養(yǎng)、調(diào)節(jié)人體免疫和腸道菌群、含有影響腸道和機(jī)體功能的生物活性物質(zhì)等，是其促進(jìn)健康的潛在機(jī)制。近年來(lái)，隨著益生菌概念的流行，益生菌的產(chǎn)品線已經(jīng)從飲食補(bǔ)充劑擴(kuò)展到臨床治療。對(duì)于益生菌，不同菌株的活細(xì)胞數(shù)是否符合標(biāo)準(zhǔn)是公眾主要關(guān)心的問(wèn)題。但是，由于國(guó)內(nèi)益生菌行業(yè)長(zhǎng)期缺乏產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，導(dǎo)致益生菌產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，許多商品的說(shuō)明書上并未標(biāo)注關(guān)于所含益生菌菌株的功效和產(chǎn)品中實(shí)際存在的活細(xì)胞數(shù)量(菌落形成單位[CFU/毫升])。因此，為規(guī)范愈發(fā)龐大的益生菌市場(chǎng)，避免益生菌產(chǎn)品市場(chǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大而出現(xiàn)的虛假夸大宣傳等亂象，對(duì)商業(yè)益生菌產(chǎn)品進(jìn)行包括快速活菌計(jì)數(shù)、原位活力測(cè)試在內(nèi)的定性和定量評(píng)價(jià)的檢測(cè)方法迫在眉睫。
 

　　然而，目前行業(yè)中廣泛應(yīng)用的方法有很大的局限性。對(duì)于益生菌產(chǎn)品的活菌計(jì)數(shù)、活性檢測(cè)等質(zhì)檢工作存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本昂貴、混合益生菌產(chǎn)品檢測(cè)效果差等問(wèn)題。為提高益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)能力，本標(biāo)準(zhǔn)提出了拉曼光譜檢測(cè)方法，對(duì)益生菌產(chǎn)品的活細(xì)胞數(shù)和原位活力進(jìn)行測(cè)定。該方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定益生菌產(chǎn)品中的活菌數(shù)和活性指標(biāo)。該方法的建立為今后豐富我國(guó)益生菌產(chǎn)品的質(zhì)控工作打下了一個(gè)良好的基礎(chǔ)，并為制定中國(guó)自己的益生菌標(biāo)簽法律法規(guī)以及檢測(cè)方法提供可靠的數(shù)據(jù)保障。
 

　　本文件按照GB/T 1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本標(biāo)準(zhǔn)分為6個(gè)部分：范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)和定義、試劑或材料、儀器設(shè)備、檢驗(yàn)要求和方法。
 

　　本文件規(guī)定了益生菌產(chǎn)品活菌計(jì)數(shù)及代謝活力的術(shù)語(yǔ)和定義、描述了益生菌活菌計(jì)數(shù)方法和代謝活力的拉曼光譜檢測(cè)方法。
 

　　本文件適用于含益生菌產(chǎn)品的活菌計(jì)數(shù)及代謝活力檢測(cè)。包括添加的植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、格氏乳桿菌、卷曲乳桿菌、乳雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌等一種或多種菌種。
 

　　檢測(cè)原理：
 

　　利用重水(D2O)同位素標(biāo)記時(shí)，具有代謝活力的細(xì)胞會(huì)同化氘(D)并代替氫(H)進(jìn)行合成代謝，使得細(xì)菌的脂類、蛋白質(zhì)、DNA 等生物質(zhì)被氘化，所產(chǎn)生新的 C-D 鍵可被拉曼光譜靈敏檢測(cè)到，并且碳-氘(C-D)峰強(qiáng)度可反映細(xì)胞的代謝活力?；诩?xì)胞的代謝活力來(lái)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，即具有代謝活力的細(xì)胞為活細(xì)胞。CDR 為 C-D 鍵的峰值光譜強(qiáng)度除以 C-D 鍵和 C-H 鍵的峰值光譜強(qiáng)度之和，以量化 C-H鍵中 D 的替代程度，即碳-氘峰值占比；所述 C-D 鍵的光譜強(qiáng)度是指在拉曼位移波數(shù)范圍(2040-2300)cm−1范圍內(nèi)的拉曼光譜強(qiáng)度；C-H 鍵的光譜強(qiáng)度是指在拉曼位移波數(shù)范圍(2800-3100)cm−1范圍內(nèi)的拉曼光譜強(qiáng)度。
 

　　儀器設(shè)備：
 

　　1.顯微拉曼光譜儀：光譜分辨率不低于5cm-1，拉曼位移波數(shù)范圍至少包含400cm-1-3200 cm-1。需配備50倍物鏡、100倍物鏡。
 

　　2.恒溫培養(yǎng)箱：溫控范圍包含36 ℃，波動(dòng)<±1 ℃；
 

　　3.振蕩重懸器：轉(zhuǎn)速覆蓋1000-2800r/min；
 

　　4.分析天平：感量0.1mg和0.01g；
 

　　5.離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速不低于5000r/min，有2-8℃制冷功能；
 

　　6.顯微鏡：數(shù)值孔徑(50倍物鏡為0.5、100倍物鏡為0.9)，視場(chǎng)數(shù)26.5；
 

　　7.真空進(jìn)樣裝置(適用于自動(dòng)化檢測(cè)法)：真空度50mbar；
 

　　8.注射泵(適用于自動(dòng)化檢測(cè)法)：流速范圍包含2μL/min；
 

　　本標(biāo)準(zhǔn)的建立不僅彌補(bǔ)了我國(guó)益生菌行業(yè)質(zhì)控方法的空白，同時(shí)對(duì)益生菌活菌計(jì)數(shù)及活性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法進(jìn)行了補(bǔ)充，很好的解決了益生菌行業(yè)長(zhǎng)期缺乏產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，導(dǎo)致益生菌產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊的問(wèn)題。