非洲豬瘟病毒熒光 PCR 核酸檢測試劑盒（快提+預(yù)分裝）
使用說明書 獸用 【操作步驟】
一、樣品制備
1、血液樣品：采集抗凝血（抗凝劑為 EDTA）或血清樣品，編號備用。
2、組織樣品：采集、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病變組織樣品或軟蜱 0.1g(黃豆粒大小)，眼科剪剪
碎于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加 1mL 生理鹽水混勻，4℃條件下 8000 rpm/分鐘離心 2 分
鐘，取上清液于滅菌離心管中，編號備用。
二、DNA 提取
取反應(yīng)液 A 20µL 分別加入到新的 1.5mL 離心管，加入抗凝血或血清或組織上清液 2 µL，混勻，室
溫（20℃左右）靜置 3 分鐘，加入反應(yīng)液 B 20 µL，吹打混勻即可，若為抗凝全血，則需 8000rpm/分鐘再
離心 2 分鐘后做為待檢 DNA 溶液。
三、PCR 擴(kuò)增
1、試劑準(zhǔn)備：根據(jù)當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（反應(yīng)數(shù)=待檢樣本數(shù)+陰性對照+陽性對照），取等量的
八聯(lián) PCR 反應(yīng)管，在室溫融化后，瞬離，并做好相應(yīng)標(biāo)記（操作過程要避光），剩余試劑放回-20℃冷凍
保存；
2、加樣擴(kuò)增：分別向 PCR 管中加入 5 µL 待檢樣本 DNA 或陰性對照或陽性對照，混勻并瞬離，放入
熒光 PCR 儀上運(yùn)行以下程序：
熒光通道選擇 FAM，在 40 循環(huán)階段每個(gè)循環(huán)的 55℃時(shí)收集熒光信號。設(shè)置擴(kuò)增體系為 25 µL，同時(shí)
要選擇 passive reference 和 quencher 為 none 的模式。
（注：若熒光 PCR 儀(如 ABI7500)按說明書中的反應(yīng)程序設(shè)置后因持溫時(shí)間短無法運(yùn)行，可將預(yù)擴(kuò)增和 PCR
擴(kuò)增條件變更為 95℃：5 秒 55℃：30 秒。）
【結(jié)果判定】
1、基線和閾值設(shè)定：參照儀器自動產(chǎn)生或設(shè)定的閾值，手動閾值參照陰性對照上線設(shè)定。
2、質(zhì)量控制：反應(yīng)結(jié)束后，陰性對照的檢測結(jié)果應(yīng)無特定的擴(kuò)增曲線，Ct 值為＞38 或無；陽性對照
的 Ct 值應(yīng)≤30.0，且明顯的擴(kuò)增曲線；否則實(shí)驗(yàn)視為無效。
3、樣品判定：待檢樣品熒光信號有指數(shù)型增加，且結(jié)果顯示 Ct 值＜35.0，報(bào)告為陽性；未檢測到 Ct
值或 Ct 值＞38 或無明顯擴(kuò)增曲線，則樣品判定為陰性。35≤Ct 值≤38 時(shí)，復(fù)檢一次，重復(fù)結(jié)果為陽性者判
定為陽性，否則判定為陰性。
【注意事項(xiàng)】
1、實(shí)驗(yàn)前請仔細(xì)閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按照操作步驟執(zhí)行，在操作過程中對時(shí)間、試劑體積等精
確控制可以獲得好的結(jié)果。
2、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定分區(qū)管理。各區(qū)間人員、器材、試劑及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格要求。
3、有關(guān)耗材確保潔凈、無菌，核酸提取完成后盡快進(jìn)入下一步試驗(yàn)或冷凍保存。
4、對于熒光 PCR 管要避免徒手或使用過的手套接觸，檢測過程中使用不帶熒光物質(zhì)一次性乳膠手套。
5、凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下融化，瞬時(shí)離心使液體沉于管底，操作時(shí)應(yīng)注意避光，避免強(qiáng)
光暴露和長時(shí)間光照。
6、樣品、陰性對照封蓋后，在通風(fēng)環(huán)境添加陽性對照并及時(shí)封蓋，避免組分間及氣溶膠等假陽性污染。
7、擴(kuò)增反應(yīng)完畢后的 PCR 管嚴(yán)禁開蓋，應(yīng)和產(chǎn)生的其它試驗(yàn)廢棄物一起及時(shí)收集，遠(yuǎn)離 PCR 實(shí)驗(yàn)室
進(jìn)行無害化處理。
【規(guī)格】48 頭份/盒。
【貯藏與有效期】-20℃以下避光保存，有效期 12 個(gè)月。
僅供獸醫(yī)診斷使用
