Ni NTA Beads 6FF是以高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質，配體與Ni NTA Beads相同。Ni NTA Beads 6FF除了可以耐受苛刻的試劑條件外，因其耐壓的基質，可以耐受高達0.3 MPa的壓力，更穩(wěn)定，因此該產品更適合用于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化，可以在相對較高的流速下，實現(xiàn)對目的蛋白的純化。

2.純化流程

2.1 緩沖液的準備

可使用下列推薦緩沖液，也可根據(jù)自己的使用習慣配置不同的緩沖液體系，基本原理就是低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高 pH上樣，低pH 洗脫。緩沖液在使用前用0.22 um 或者0.45 um 濾膜過濾。因為 Ni NTA Beads 6FF 可以用于可溶蛋白和包涵體蛋白的純化，兩種方法所需緩沖液不同。具體配置方法見表3、表4和表5。

2.2 樣品準備

2.2.1 細菌或酵母表達的蛋白

1）挑取單菌落到培養(yǎng)基中，根據(jù)載體使用說明，加入相應濃度的誘導劑誘導相應的時間。

2）表達結束后，將培養(yǎng)液轉移到離心杯中，7，000 rpm（7，500×g），離心 15min 收集菌體，然后按照菌體∶Lysis Buffer=1∶10（W/V）加入Lysis Buffer，加入終濃度為1mM的 PMSF。加入（工作濃度為0.2-0.4 mg/ml，如果表達的宿主細胞內含pLysS 或 pLysE，可以不加），（同時也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹脂的結合）。

3）將菌體沉淀懸浮起來，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10 ug/ml RNase A和5 ug/ml DNase I），混勻，放置于冰上，然后冰上超聲

破碎細胞，至菌液基本保持澄清。

4）將澄清的破碎液轉移至離心管中，10.000 rpm（15.000×g），4℃離心20-30 min。取上清，置于冰上備用或-20℃C保存。

2.2.2 酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達可溶性蛋白

1）將細胞培養(yǎng)液轉移至離心杯，5，000 rpm（3，800×g），離心10 min，收集菌體得上清，如上清中不含 EDTA、和還原劑等物質，即可直接加入柱子使用;如含有 EDTA、和還原劑等物質，需用Lysis Buffer 透析才能加入柱子。

2）對于大量體積的上清，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，蛋白還需用Lysis Buffer 透析后才能加入柱子。

2.2.3 包涵體蛋白純化（變性條件）

1）將培養(yǎng)液轉移到離心杯中，7，000 rpm（7，500×g），離心 15min 收集菌體，去掉上清。

2）按照菌體∶Lysis buffer（不含 8M 尿素）=1∶10（W/V）將菌體懸浮起來混勻，冰浴超聲破碎。

3）將破碎液轉移至離心管中，10，000 rpm（15.000×g），4°C離心20-30 min。去掉上清，步驟2和3可以重復一次。

4）按照菌體∶Lysis buffer（含8M 尿素）=1∶10（W/V）將包涵體懸浮起來。

5）變性條件下進行His 標簽蛋白純化，具體緩沖液配方見表4、表 5。

2.3 Ni NTA Beads 6FF的裝填

2.3.1重力柱的裝填

1）取合適規(guī)格的重力層析柱，裝入下墊片，加入適量純水潤洗柱管和墊片，關閉下出口。

2）將 Ni NTA Beads 6FF 混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質實際體積占懸液的一半），打開下出口流干保護液。

3）加入適量純水沖洗介質，待柱管中液體重力流干后，關閉下出口。

4）裝入潤洗后的上墊片，確保墊片與填料之前沒有空隙，且保持水平。

5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進行平衡，暫不使用時則加入保護液，4-30℃保存。

2.3.2 中壓層析柱的裝填

Ni NTA Beads 6FF被廣泛應用于工業(yè)純化，因此，涉及到各種中壓色譜層析柱的填裝，下面介紹 Ni NTABeads6EF填裝層析柱的方法。裝柱前根據(jù)層析柱直徑計算柱子底面積，根據(jù)所需裝柱高度計算所需介質體積，公式如下;  V=1.15022h

• V∶所需介質體積 ml
• 1.15∶壓縮系數(shù)
• r∶柱管半徑 cm 
• h∶裝填高度 cm

注意∶所取懸液體積應為介質體積的兩倍，因為介質體積只占懸液總體積的一半，另一半為保護液。

1）用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無氣泡，關閉柱底出口，并在柱底部留出1-2 cm 的去離子水。

2）將介質懸浮起來，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產生。

3）如果使用儲液器，應立即在層析柱和儲液器中加滿水，將進樣分配器放置于漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進樣管中產生氣泡。4）打開層析柱底部出口，開啟泵，使其在設定的流速下進行。最初應讓緩沖液緩慢流過層析柱，然后緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對所形成柱床的沖擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如果達不到推薦的壓力或流速，可以用你所使用泵的流速，這樣也可以得到一個很好的裝填效果。（注意∶在隨后的色譜程序中，不要超過裝柱流速的75%）當柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱床體積的去離子水。標上柱床高度。5）關閉泵，關閉層析柱出口。

6）如果使用儲液器，去除儲液器，將分配器置于層析柱中。

7）將分配器推向柱子至標記的柱床高度處。允許裝柱液進入分配器，鎖緊分配器接頭。8）將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，開始平衡。如果需要可以重新調整分配器。

2.4 樣品純化流程2.4.1 孵育法純化

1）根據(jù)純化的樣品量，取適量 Ni NTA Beads 6FF 加入離心管中，1000 rpm 離心 1min，吸棄上清;也可加入重力柱中，流干保護液。2）向離心管中加入5倍介質體積的Lysis Buffer 清洗介質，1000 rpm離心1min，吸棄上清;如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗，直接重力流干 Lysis Buffer;重復兩次以上。

3）加入樣品，封閉離心管或重力柱管，4℃振蕩孵育2-4 h或者37℃孵育 30 min-2 h。

4）孵育結束后，1000 rpm 離心1min，吸棄上清，或過濾收集介質，上清保留作為流穿，用于電泳鑒定。

5）用5倍介質體積的Wash Buffer清洗介質，1000 rpm離心1 min 或重力柱管過濾，去除上清（注意不要吸到介質），重復3-5次，中間建議更換新離心管。必要時可以調整咪唑的濃度進行洗雜。

6）加入3-5倍柱體積的Elution Buffer 進行洗脫，室溫孵育 10-15min，1000 rpm離心1 min 或重力柱管收集洗脫液，可重復 2-3次。

2.4.2 重力柱法純化

1）將裝填好的 Ni NTA Beads 6FF 重力柱用5倍柱體積 Lysis Buffer進行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下，重復 2-3次。2）將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時間至少2 min，保證樣品和介質充分接觸，收集流出液，可以反復上樣增加結合效率。

3）用 10-15倍柱體積的 Wash Buffer 進行洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。必要時可以調整咪唑的濃度進行洗雜。

4）使用5-10倍柱體積的 Elution Buffer洗脫，分段收集，每一個柱體積收集一管，分別檢測，既可以保證所有結合的目的蛋白被洗脫，又可以得到高純度和高濃度的蛋白。

2.4.3 中壓層析柱法純化

Ni NTA Beads 6FF裝填好后，可以用各種常規(guī)的中低壓色譜系統(tǒng)。

1）將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子，將層析柱連接至色譜系統(tǒng)中，打開下出口，將預裝柱接到色譜系統(tǒng)中，并旋緊。

2）用 3-5倍柱體積的去離子水沖洗出儲存緩沖液。

3）使用至少5倍柱床體積的 Lysis Buffer 平衡色譜柱。

4）利用泵或樣品環(huán)上樣。注;樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少，也會導致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過柱子的結合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進樣器更難使用。

5）用Wash Buffer 沖洗柱子，直到紫外吸收達到一個穩(wěn)定的基線（一般至少10-15個柱體積）。

注∶在樣品和結合緩沖液中加入咪唑可以提高樣品純度。

6）用Elution Buffer采用一步法或線性梯度洗脫。

一步洗脫中，通常5倍柱體積洗脫液就足夠了。梯度洗脫可以用一個小的梯度，例如20 倍柱體積或更多，來分離不同結合強度的蛋白質。

上述步驟介質洗脫結束后，先用 Lysis Buffer 沖洗3倍柱體積，然后用純水沖洗5倍柱體積，再用20%乙醇沖洗2個柱體積，然后將介質置于2-8℃保存。

2.5 SDS-PAGE 檢測

將使用純化產品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用 SDS-PAGE檢測純化效果。

3.在位清洗

當填料使用過程中發(fā)現(xiàn)反壓過高或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時，需要進行在位清洗操作（Cleaning-in-Place，CIP）。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。去除強疏水結合的蛋白，脂蛋白和脂類

通過使用 30%異丙醇清洗 5-10個柱體積，接觸時間為 15-20 min 可以去除此類污染物。然后，再使用 10倍柱體積的去離子水清洗。也可

使用1.5M NaCI溶液清洗 10-15 min。然后，再使用去離子水清洗 10個柱體積。

4.填料再生

標簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經常螯合去除和重新掛鎳離子。當填料使用過程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺，或者填料載量明顯變低時，需要進行對填料進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子，也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內，按照下面操作流程進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子。

1）使用5倍柱體積去離子水清洗填料;

2）使用5倍柱體積 100 mM EDTA （pH 8.0）剝落鎳離子;3）使用 10倍柱體積去離子水清洗填料;

4）使用0.5M NaOH清洗5倍柱體積，停留 10-15min;5）使用去離子水清洗填料，直至 pH中性;6）使用3-5倍柱體積 100 mM NiSO4再生掛鎳;7）使用10倍柱體積去離子水清洗;

填料再生后，可以立即使用，如不立即使用，需要將填料懸浮于等體積的 20%乙醇中，置于4-30°℃ 保存。

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