細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)需要怎樣的環(huán)境？
細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)需要怎樣的環(huán)境？
一、無菌室
無菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。
無菌室的消毒和防污染：為保持無菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小時(shí)），每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。
實(shí)際工作中，要根據(jù)無菌室建筑材料的差異來選擇合適的消毒方法。
此外，還應(yīng)注意防止無菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括：送入無菌室的風(fēng)沒有被過濾除菌；進(jìn)出無菌室時(shí)，能使外界空氣直接對流進(jìn)無菌室的操作間；等。
二、超凈工作臺
工作原理：鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效過濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺面空間而將其中的塵埃、細(xì)菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構(gòu)成無菌環(huán)境。根據(jù)氣流在超凈工作臺的流動(dòng)方向不同，可將超凈工作臺分為側(cè)流式、直流式和外流式三種類型。
超凈臺的使用與保養(yǎng)：超凈臺的平均風(fēng)速保持在0.32-0.48米/秒為宜，過大、過小均不利于保持凈化度；使用前好開啟超凈臺內(nèi)紫外燈照射10－30分鐘，然后讓超凈臺預(yù)工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)；使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈，以超凈臺無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺。
三、常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒
細(xì)胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類、紙類等，因此掌握清洗、消毒知識，學(xué)會(huì)清洗、消毒方法是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的。
清洗
離體條件下，有害物質(zhì)直接同細(xì)胞接觸，細(xì)胞對有害物質(zhì)十分敏感，極少殘留物都可以對細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都認(rèn)真清洗，達(dá)到不含殘留物的要求。
（一）玻璃器皿的清洗 一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個(gè)步驟。
1、浸泡 : 新的或用過的玻璃器皿要先用清水浸泡，軟化和溶解附著物。新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗，然后用5％鹽酸浸泡過夜；用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。
2、刷洗 : 將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。
3、浸酸 : 浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強(qiáng)氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應(yīng)少于六小時(shí)，一般過夜或更長。放取器皿要小心。
4、沖洗 : 刷洗和浸酸后的器皿都用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細(xì)胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復(fù)“注水－倒空”15次以上，后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包裝備用。
（二）橡膠制品清洗
新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。
（三）塑料制品的清洗
塑料制品特點(diǎn)：質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強(qiáng)、但不耐熱。
清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時(shí)，晾干備用。
（四）包裝 : 對細(xì)胞培養(yǎng)用品進(jìn)行消毒前，要進(jìn)行嚴(yán)密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養(yǎng)皿等，近幾年用鋁箔包裝，非常方便，適用。培養(yǎng)皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內(nèi)，較大的器皿可以進(jìn)行局部包扎。
消毒和滅菌
微生物污染是造成細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因
（一）物理消毒法
1、紫外線消毒:紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。革蘭陰性菌為敏感，其次是陽性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力強(qiáng)。紫外線的直接作用是通過破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡單，效果好。
紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強(qiáng)度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強(qiáng)度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時(shí)間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時(shí)間要適合。離地面2米的30W燈可照射9平方米房間，每天照射2－3小時(shí)，期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長照射時(shí)間，2.5米照射效果較差。紫外燈照射工作臺的距離不應(yīng)超過1.5米，照射時(shí)間30分鐘為宜。
紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害，且對培養(yǎng)細(xì)胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開著紫外等操作。
2、高溫濕熱滅菌:壓力蒸汽滅菌是常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。
不同壓力蒸汽所達(dá)到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時(shí)間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體），應(yīng)立即放到60-70℃烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆?，否則，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡單、使用方便等特點(diǎn)。
3、高溫干熱消毒：干熱滅菌主要是將電熱烤箱內(nèi)物品加熱到160℃以上，并保持90－120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶）、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品（如粉劑、油劑）。
干熱滅菌后要關(guān)掉開關(guān)并使物品逐漸冷卻后在打開，切忌立即打開，以免溫度驟變而使箱內(nèi)的玻璃器皿破裂。干烤箱內(nèi)物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。
燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺面上的酒精燈的火焰對金屬器皿及玻璃器皿口緣進(jìn)行燒灼消毒。
4、過濾除菌：是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。在體外培養(yǎng)時(shí)，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。目前，大多實(shí)驗(yàn)室采用微孔濾膜濾器除菌。
關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。
（二）化學(xué)消毒：新潔而滅，其0.1％水溶液可對器械、皮膚、操作表面進(jìn)行擦拭和浸泡消毒。
（三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。
可用于細(xì)胞培養(yǎng)的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有的適應(yīng)范圍。如常用的過濾除菌系統(tǒng)、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實(shí)驗(yàn)室空氣；多用新潔而滅消毒實(shí)驗(yàn)室地面；常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養(yǎng)用器皿；采用高壓蒸汽滅菌或過濾除菌方法消毒培養(yǎng)液。
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