革蘭氏染色的實(shí)驗(yàn)原理與方法步驟！
革蘭氏染色的實(shí)驗(yàn)原理與方法步驟！
革蘭氏染色（Gram Staining）是用來鑒別細(xì)菌的一種方法：這種染色法利用細(xì)菌細(xì)胞壁上的生物化學(xué)性質(zhì)不同，可將細(xì)菌分成兩類，即革蘭氏陽性（Gram Positive）與革蘭氏陰性（Gram Negative）。這一染色方法由丹麥醫(yī)生漢斯·克里斯蒂安·革蘭于1884年所發(fā)明，初是用來鑒別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關(guān)系，后推廣為鑒別細(xì)菌種類的重要特性之一，對由細(xì)菌感染引起的疾病的臨床診斷及治療有著廣泛用途。
⒈步驟
革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法是：
1）涂片固定。
2）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。
3）蒸餾水沖洗。
4）加碘液覆蓋涂面染約1分鐘。
5）水洗，用吸水紙吸去水分。
6）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進(jìn)行脫色，20秒后水洗，吸去水分。
7）蕃紅染色液（?。┤?分鐘后，蒸餾水沖洗。干燥，鏡檢。
⒉原理
通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
染色的差異主要是陰性與陽性細(xì)菌細(xì)胞壁的差異所引起的。
①革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁
G+細(xì)菌細(xì)胞壁具有較厚（20-80nm）而致密的肽聚糖層，多達(dá)50層，占細(xì)胞壁成分的40%～95%，它同細(xì)胞膜的外層緊密相連（圖2-9）。有的G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也稱胞壁質(zhì)（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸帶負(fù)電荷，它在細(xì)胞表面能調(diào)節(jié)陽離子濃度。磷壁酸與細(xì)胞生長有關(guān)，細(xì)胞生長中有自溶素（autolysins）酶類起作用，磷壁酸對自溶素有調(diào)節(jié)功能，阻止胞壁過度降解和壁溶。
如果細(xì)胞壁的肽聚糖層被消溶，G+細(xì)胞成為原生質(zhì)體（protoplasts），細(xì)胞壁不復(fù)存在，而只存留細(xì)胞膜。除鏈球菌外，大多數(shù)G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含極少蛋白質(zhì)。
②革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁 G—細(xì)菌細(xì)胞壁比G+細(xì)菌細(xì)胞壁?。?5～20nm）而結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，分外膜（outer membrane）和肽聚糖層（2～3nm）（圖2-10）。在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜之間有一個(gè)明顯的空間，稱為壁膜間隙（periplasmic space）。
外膜 G—細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同細(xì)胞質(zhì)膜相同之處也是雙層類脂，但除磷脂外還含有多糖和蛋白質(zhì)。
LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特異多糖。O-特異多糖由重復(fù)分支的碳水化合物分子組成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脫氧已糖。由于糖的種類不同，使各種G—細(xì)胞具有不同特性的LPS。核心多糖（core polysaccharide）的主要組分是酮脫氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。
外膜中還含有幾種蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用（porin），調(diào)控外界分子進(jìn)入細(xì)胞；有的蛋白分子可以作為噬菌體的受體；許多G—細(xì)菌對高等生物有致病性是由LPS的成分決定的，它的毒性組分常稱為內(nèi)毒素（endotoxins）。
肽聚糖層 G—細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層很薄，在大腸桿菌和其它細(xì)菌中僅有單層。肽聚糖層和外膜的內(nèi)層之間通過脂蛋白連接起來。
壁膜間隙 G—細(xì)菌細(xì)胞壁的外膜與細(xì)胞質(zhì)膜之間存在明顯的壁膜間隙，一層薄的肽聚糖處于其間，肽聚糖層和細(xì)胞質(zhì)膜之間的間隙較寬，肽聚糖層至外膜之間的間隙較窄。大腸桿菌的壁膜間隙寬度為12～15nm，呈膠胨態(tài)。其間含有三類蛋白質(zhì)：水解酶，催化食物的初步降解；結(jié)合蛋白，啟動物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程；化學(xué)受體（chemoreceptors），在趨化性中起作用的蛋白。
⒊染色結(jié)果
革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。
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