組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板:一塊(96孔)
2、 標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品): 2瓶,請(qǐng)臨用15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,其濃度為200 U/L,然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?,分別配制成200 U/L,100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品:取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液:1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A:1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B:1×10ml。
溶藻弧菌核酸檢測(cè)試劑盒(恒溫?zé)晒夥ǎ?/strong>優(yōu)點(diǎn):①靈敏度高、特異性強(qiáng)。
②時(shí)間短,2-3小時(shí)出結(jié)果。
③檢測(cè)結(jié)果可定量。
④操作簡(jiǎn)便。
缺點(diǎn):①對(duì)于已做支原體滅活處理的樣品,由于支原體DNA仍舊存在其中,PCR結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。(可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證)
②不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大(由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同),需謹(jǐn)慎選擇,盡量在業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。
【質(zhì)量控制】
1.陰性對(duì)照:Ct 值>38 或未檢出。
2.陽(yáng)性對(duì)照:擴(kuò)增曲線(xiàn)呈 S 型,且 Ct 值≤30。
3.同一實(shí)驗(yàn)以上要求需同時(shí)滿(mǎn)足,否則本次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
4.每種檢測(cè)靶標(biāo)都需設(shè)陰陽(yáng)對(duì)照,不同的靶標(biāo)根據(jù)對(duì)應(yīng)陰性調(diào)整基線(xiàn)閾值。
【結(jié)果判讀】
1.FAM 通道檢測(cè) B 組鏈球菌。
2.陰性:Ct 值>38 或未檢出。
3.陽(yáng)性:擴(kuò)增曲線(xiàn)呈 S 型,且 Ct 值≤35。
4.可疑:擴(kuò)增曲線(xiàn)呈 S 型,且 35<Ct 值≤38,需復(fù)檢;復(fù)檢結(jié)果若一致,判定結(jié)果為陽(yáng)性。
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1.樣品采集、運(yùn)輸、保存不當(dāng),試劑運(yùn)輸、保存、配置不當(dāng)都可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,甚至?xí)?dǎo)致假陰性結(jié)果。
2.如果實(shí)驗(yàn)室污染、試劑污染、樣品交叉污染,可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
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