本試劑盒是用FITC標(biāo)記的重組人Annexin V來檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨suan的一種細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒?？梢允褂昧魇郊?xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。一個(gè)包裝的本試劑盒共可以檢測(cè)20個(gè)細(xì)胞樣品。

試劑盒組份：

Annexin V-FITC——————100μl

Annexin V-FITC結(jié)合液———12ml

碘化丙啶染色液——————220μl

Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報(bào)道可以調(diào)控一些PKC的活性。

Annexin V選擇性結(jié)合磷脂酰絲氨suan(phosphatidylserine，簡(jiǎn)稱PS)。磷脂酰絲氨suan主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會(huì)把磷脂酰絲氨suan外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷脂酰絲氨suan暴露到細(xì)胞表面后會(huì)促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨suan結(jié)合后可以阻斷磷脂酰絲氨suan的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。

用帶有綠色熒光的熒光探針FITC標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡(jiǎn)單而直接地檢測(cè)到磷脂酰絲氨suan的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。

本試劑盒還提供了碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液，碘化丙啶可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對(duì)于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-FITC可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨suan結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。

本試劑盒的流式檢測(cè)效果參考圖1和圖2，熒光顯微鏡檢測(cè)效果參考圖3。

1.細(xì)胞用本試劑盒染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的效果圖。Jurkat細(xì)胞未經(jīng)處理(A)或用10μM(Camptothecin)作用4小時(shí)(B)后，用本試劑盒染色，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞的散射和熒光檢測(cè)。從圖中可以看出，經(jīng)過凋亡誘導(dǎo)劑處理后的細(xì)胞，其Annexin V-FITC染色陽性并且PI染色陰性的細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，明顯增加(B圖的右下象限)，Annexin V-FITC和PI染色雙陽性的細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，也有所增加(B圖的右上象限)。圖中Annexin V-FITC染色陰性PI染色陽性(Annexin V-/PI+)所在象限(A和B圖的左上象限)出現(xiàn)的細(xì)胞點(diǎn)是許可范圍內(nèi)的檢測(cè)誤差。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)可能會(huì)因細(xì)胞類型、細(xì)胞凋亡情況、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

2.細(xì)胞用本試劑盒染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)效果驗(yàn)證圖。Jurkat細(xì)胞用10μM(Camptothecin)作用4小時(shí)后，未經(jīng)染色(A)、僅用本試劑盒中的PI進(jìn)行染色(B)、僅用本試劑盒中的Annexin V-FITC進(jìn)行染色(C)、用本試劑盒中的Annexin V-FITC和PI進(jìn)行雙染(D)。從圖中可以看出，未經(jīng)染色的是雙陰性細(xì)胞(A)，僅PI染色后出現(xiàn)了預(yù)期的PI染色陽性的細(xì)胞，僅Annexin V-FITC染色出現(xiàn)了預(yù)期的Annexin V-FITC染色陽性的細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI雙染出現(xiàn)了預(yù)期的僅Annexin V-FITC染色陽性的凋亡細(xì)胞和雙陽性的壞死細(xì)胞。出現(xiàn)的非預(yù)期的細(xì)胞點(diǎn)*在許可的誤差范圍內(nèi)。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)可能會(huì)因細(xì)胞類型、細(xì)胞凋亡情況、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

儲(chǔ)存條件：4℃避光，有效期6個(gè)月。

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。