PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號(hào) |
5(6)-羧基熒光素（混合物） | 100 mg/1 g/5 g | BJP1211 |
熒光定量PCR原理:
產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。
一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。
?
實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
?
定量PCR方法:
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。
CEM/C1（人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞）說明書PEN2 Antibody100 ul
HFSF（人胚胎眼鞏膜成纖維細(xì)胞）說明書Pim-1 (D8D7Y) Rabbit mAb10 ug
INS-1（大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞）說明書Human <sub>His6</sub>Fas Ligand/TNFSF6 (h<sub>His6</sub>FasL)10 ug
KP-N-NS（人腎上腺神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（腦轉(zhuǎn)移））報(bào)價(jià)Human <sub>His6</sub>Fas Ligand/TNFSF6 (h<sub>His6</sub>FasL)100 ul
大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞*培養(yǎng)基現(xiàn)貨供應(yīng)TNFRSF8/CD30 (E4L4I) XP® Rabbit mAb20 ul
DMEM高糖 （不含L-谷氨酰、丙酮酸鈉、Ca2+）報(bào)價(jià)TNFRSF8/CD30 (E4L4I) XP® Rabbit mAb100 ul
8-香葉草氧基補(bǔ)骨脂素7437-55-0價(jià)格Mcl-1 (D35A5) Rabbit mAb20 ul
偽原纖細(xì)薯蕷皂苷637349-03-2實(shí)驗(yàn)方法Mcl-1 (D35A5) Rabbit mAb100 ul
6-姜酚23513-14-6實(shí)驗(yàn)方法Phospho-HNF1α (Ser247) Antibody100 ul
α－常春藤苷35790-95-5實(shí)驗(yàn)方法Fascin (55k-2) Mouse mAb100 ul
大黃素-1-O-葡萄糖苷38840-23-2實(shí)驗(yàn)步驟NKX6.1 (D8O4R) Rabbit mAb100 ul
大蒜素539-86-6實(shí)驗(yàn)步驟Cas9 (<i>S. pyogenes</i>) (D8Y4K) Rabbit mAb (PE Conjugate)100 ul
牛熊去氧膽酸鈉14605-22-2 實(shí)驗(yàn)步驟BRSK2 (D29B6) Rabbit mAb100 ul
（+）兒茶素225937-10-0 *Synaptophysin (D35E4) Rabbit mAb20 ul
甲基橙皮苷11013-97-1 ?*Synaptophysin (D35E4) Rabbit mAb100 ug
科羅索酸4547-24-4實(shí)驗(yàn)步驟Bafilomycin A1100 ul
雷公藤次堿11088-09-8價(jià)格Phospho-c-Jun (Ser63) (54B3) Rabbit mAb (Biotinylated)100 ul
5(6)-羧基熒光素（混合物）Pichia│pastoris斜面培養(yǎng)物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 表達(dá)、分泌生產(chǎn)磷脂酶培養(yǎng)基: 0013生長條件: 25-28℃存儲(chǔ)條件: -80℃冰箱凍結(jié)法；真空冷凍干燥法；礦物油法
Pseudomonas│sp.凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 0002生長條件: 30℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法;真空冷凍干燥法
Clostridium│acetobutylicum凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 丙酮丁醇培養(yǎng)基: 0004生長條件: 35℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法;真空冷凍干燥法
Ustilago│spermophora分離基物: 蝴蝶凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 0013生長條件: 17-25℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法;真空冷凍干燥法
Lactobacillus│plantarum分離基物: 污泥凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 6生長條件: 37℃存儲(chǔ)條件: -80℃冰箱凍結(jié)法;真空冷凍干燥法
方形鹽盒菌種屬: Haloarcula│quadrata凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: yes應(yīng)用領(lǐng)域: 模式菌株培養(yǎng)基: 0212生長條件: 37℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法;真空冷凍干燥法
Saccharomyces│cerevisiae斜面培養(yǎng)物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 酒精釀造培養(yǎng)基: CM0077生長條件: 28℃存儲(chǔ)條件: -80℃冰箱凍結(jié)法
銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)種屬: Pseudomonasaeruginosa分離基物: 動(dòng)物房水的瓶子安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 測定抗菌防腐劑，紡織品的細(xì)菌耐藥性檢測，藥效試驗(yàn)，質(zhì)量控制菌株。培養(yǎng)基: 2、109生長條件: 37℃
Streptomyces│albus斜面培養(yǎng)物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 0012生長條件: 28℃存儲(chǔ)條件: -80℃冰箱凍結(jié)法；真空冷凍干燥法
實(shí)驗(yàn)過程:
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1（10pM） 2μl
引物2（10PM） 2μl
Taq酶（2U/μl） 1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
