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質(zhì)量過(guò)載

質(zhì)量過(guò)載又稱為濃度過(guò)載，就是指在小體積進(jìn)樣時(shí)（體積未過(guò)載），由于進(jìn)樣濃度較高，靠近譜峰峰帶的固定相被飽和，也就是說(shuō)，進(jìn)樣某一組分超過(guò)了色譜柱的載樣量而出現(xiàn)過(guò)載的現(xiàn)象。一般表現(xiàn)為色譜峰峰形拖尾，柱效較低。

在小體積進(jìn)樣時(shí)，如果質(zhì)量未超載，隨著樣品量的增加（a

隨著樣品量繼續(xù)增加，進(jìn)到色譜柱中的樣品達(dá)到飽和，譜峰就變形了。

可以看出，隨著進(jìn)樣質(zhì)量不斷增加，譜峰峰寬不斷增加，最終變成了直角三角形的形狀，同時(shí)譜峰的理論塔板數(shù)也不斷降低。通常，對(duì)于內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，其載樣量<50μg。如果是做方法轉(zhuǎn)移到其他色譜柱上，則需要調(diào)整進(jìn)樣量，防止出現(xiàn)過(guò)載。

載樣量主要與色譜柱固定相和待分析物的性質(zhì)有關(guān)。首先固定相類型不一樣，品牌不一樣會(huì)造成載樣量較大的差異。其次待分析物質(zhì)性質(zhì)也會(huì)直接影響到色譜柱載樣量。例如離子態(tài)的堿性化合物就很容易過(guò)載，不僅無(wú)法達(dá)到<50μg的量級(jí)，有時(shí)候甚至1μg的量就能造成過(guò)載的現(xiàn)象。因此在常規(guī)疏水反相中，分子態(tài)的堿性化合物比離子態(tài)的堿性化合物有著更高的載樣量。目前的推測(cè)原因是，離子態(tài)間互相排斥作用使得待分析組分在固定相表面更易達(dá)到飽和而造成過(guò)載。同時(shí)離子態(tài)的帶正電的堿性化合物也更容易和固定相中未鍵合的活性硅羥基發(fā)生次級(jí)相互作用。針對(duì)質(zhì)量超載的問(wèn)題，最簡(jiǎn)單的方法則是減少進(jìn)樣量。

另外，混合樣品進(jìn)樣中過(guò)載還會(huì)導(dǎo)致峰保留時(shí)間的變化。

例如圖中，A’，B’為AB組分單獨(dú)進(jìn)樣時(shí)的保留分離情況。A，B為混合進(jìn)樣時(shí)的保留分離情況。過(guò)載的B不管是單獨(dú)進(jìn)樣還是混合進(jìn)樣，均保持穩(wěn)定，而A由于過(guò)量B的存在，在混合進(jìn)樣時(shí)，保留時(shí)間提前。

雖然每個(gè)成分的過(guò)載是相對(duì)獨(dú)立的，但是在混合樣品進(jìn)樣過(guò)程中會(huì)引起的分離度問(wèn)題。這是由于環(huán)境對(duì)組分的影響。其中某一組分過(guò)載很可能造成混合進(jìn)樣時(shí)保留時(shí)間相對(duì)于單獨(dú)進(jìn)樣時(shí)有所改變。

體積過(guò)載

進(jìn)樣體積太大通常會(huì)導(dǎo)致較寬的平頭峰。

從圖中可以看出，隨著進(jìn)樣體積的增大，峰寬逐漸變寬，峰分離度降低。

另外體積過(guò)載還會(huì)影響峰保留時(shí)間，體積過(guò)載對(duì)保留時(shí)間短的組分影響更大，而對(duì)于較后面流出的峰影響較小。

圖中虛線為正常體積進(jìn)樣，實(shí)線色譜圖為體積過(guò)載后的色譜圖。

那么，如何選擇合適的進(jìn)樣體積呢？

對(duì)于在流速下 ，允許樣品進(jìn)樣的體積為：

常用的各規(guī)格色譜柱：

盡管上表中各個(gè)數(shù)據(jù)是嚴(yán)格按照公式計(jì)算出來(lái)的，但是這個(gè)數(shù)據(jù)并不。色譜是經(jīng)驗(yàn)科學(xué)，較之其他學(xué)科需要更多的實(shí)踐。當(dāng)然，理論也為我們指引了方向，讓我們能少走彎路。

影響過(guò)載的因素及解決辦法

1、柱容量

柱容量越大越不容易過(guò)載。決定柱容量的指標(biāo)是柱截面上固定相的面積占比，它與空容、填料的比表面積、表面健合率等色譜參數(shù)有關(guān)。

 需要注意的是，增加柱長(zhǎng)并不能增加柱容量，因?yàn)闃悠愤M(jìn)樣后不可能立即分布于整個(gè)色譜柱，同樣因?yàn)闊o(wú)限直徑效應(yīng)的緣故，增大柱內(nèi)徑也不能增大柱容量。

2、進(jìn)樣量

顯然，減小進(jìn)樣量可以緩解過(guò)載，有時(shí)還能夠達(dá)到分離雜質(zhì)的效果。進(jìn)樣量減小一半，主成分前相鄰雜質(zhì)峰從主成分峰中分離出來(lái)，但方法對(duì)雜質(zhì)的檢出能力也隨著降低。

3、組分分配到固定相中的量

柱容量一定時(shí)，分配到固定相中的量越少，保留越小，柱越不容易過(guò)載。理論上，在固定相中不分配時(shí)，組分不保留，再大的進(jìn)樣量也不會(huì)出現(xiàn)過(guò)載。對(duì)于C18/C8健合固定相，可以通過(guò)增加有機(jī)相比例減小組分在固定相中的分配來(lái)緩解過(guò)載，當(dāng)然，隨著有機(jī)相的改變，方法選擇性也會(huì)發(fā)生變化。

4、組分的存在方式

對(duì)于易解離組分如酸堿性物質(zhì)，在流動(dòng)相緩沖容量足夠的情況下，譜帶上任一點(diǎn)解離型（離子）和非解離型（分子）的比例始終一致，離子型和分子型相伴以恒定的比例流出色譜柱，出現(xiàn)的色譜峰是離子型和分子型的疊加。

如果其中一個(gè)組分過(guò)載，表現(xiàn)出一個(gè)拖尾的色譜峰，另一組分雖未過(guò)載，但由于上述原因，也會(huì)表現(xiàn)為和過(guò)載組分形狀一致大小不同的過(guò)載峰。因此易解離組分的峰型由過(guò)載的那一種存在方式?jīng)Q定。

 一般離子型比分子型組分更容易過(guò)載，故易解離組分的過(guò)載由離子型的過(guò)載決定，過(guò)載程度與其占比有關(guān)。一般通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相pH抑制組分解離可大大減小離子型比例，緩解甚至消除過(guò)載。

 對(duì)于強(qiáng)酸/堿性物質(zhì)，難以通過(guò)調(diào)節(jié)pH抑制解組分的解離，這個(gè)時(shí)候可以通過(guò)形成離子對(duì)復(fù)合物來(lái)減小離子型占比以緩解過(guò)載。同樣地，過(guò)載由離子型決定，形成的離子對(duì)復(fù)合物越多，離子型就越少，過(guò)載就越能得到緩解。

 更復(fù)雜的情況是既抑制解離又存在離子對(duì)試劑的時(shí)候，這個(gè)時(shí)候可以通過(guò)上述兩方面來(lái)改變離子型的占比，既可以緩解過(guò)載拖尾，又可以調(diào)整保留。情況雖然復(fù)雜，但手段卻更加靈活多樣。

5、鹽的濃度

對(duì)于離子型組分在C18/C8固定相上易于過(guò)載的原因，主要是因?yàn)殡x子型組分一旦進(jìn)入固定相以后，離子間的排斥作用會(huì)阻止組分的進(jìn)一步進(jìn)入。

 我們通常使用緩沖鹽主要是為了維持流動(dòng)相有足夠的緩沖容量，但另一方面緩沖鹽甚至是中性鹽的加入還可以增加流動(dòng)相離子強(qiáng)度，部分屏蔽組分離子間的相互排斥作用，減輕過(guò)載。同時(shí)鹽還可以與離子組分形成離子對(duì)復(fù)合物，降低組分離子型比例來(lái)緩解過(guò)載。鹽濃度越大，效果越明顯。

 緩沖鹽與離子型組分形成離子對(duì)復(fù)合物所占比例到底有多少一直是筆者想知道的一個(gè)問(wèn)題。其比例可以通過(guò)下式進(jìn)行計(jì)算：

k’=x離子型﹒k’離子型+x離子對(duì)型﹒k’離子對(duì)型

x為各存在方式的占比，k’為相應(yīng)的容量因子。

 離子對(duì)復(fù)合物的保留應(yīng)與分子型的保留相當(dāng)，考慮到組分堿性較強(qiáng)，要測(cè)定組分分子型的保留值，需要抑制組分解離，流動(dòng)相pH需要高達(dá)12以上，這在普通的C18柱上難以實(shí)現(xiàn)，故以伯氨基被酰胺取代的化合物代替該物質(zhì)的分子型，并以此測(cè)得的保留值作為離子對(duì)復(fù)合物的保留值來(lái)及計(jì)算k’離子對(duì)型。 

k’離子型用緩沖液鹽濃度時(shí)（5mmol/L）的k’代替。

各緩沖液濃度下組分色譜峰均存在不同程度過(guò)載拖尾，故保留時(shí)間以色譜峰結(jié)束時(shí)的時(shí)間估算，應(yīng)不至于產(chǎn)生太大誤差（其實(shí)應(yīng)于各條件下取低濃度組分進(jìn)樣，色譜峰不至于過(guò)載，能獲得組分的準(zhǔn)確保留值）。

6、梯度洗脫

在梯度洗脫過(guò)程中，一方面隨著流動(dòng)相有機(jī)相比例逐漸增加，組分在固定相中的分配也逐漸降低，過(guò)載的累積也就逐漸減輕。另一方面，對(duì)于低有機(jī)相比例洗脫時(shí)組分已經(jīng)形成過(guò)載峰這一既定事實(shí)，梯度洗脫的所謂“譜帶壓縮機(jī)制”也可以進(jìn)行部分“逆轉(zhuǎn)”。

對(duì)于過(guò)載的譜帶，組分濃度沿著柱入口到柱出口方向逐漸增加，而高有機(jī)相比例的流動(dòng)相總是首先到達(dá)靠近柱入口的低濃度組分譜帶區(qū)域，使它們不停追趕靠近柱出口的高濃度組分，最終使譜帶壓縮，以前過(guò)載拖尾的峰型得到緩解。