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光路長(zhǎng)度（OPL）是介質(zhì)的折射率（n）與光線在介質(zhì)中兩點(diǎn)之間傳播距離（d）的乘積。OPL = nd。光路可能需要光線穿過(guò)多種介質(zhì)，例如氣體、液體或固體。常見(jiàn)示例包括光線從空氣進(jìn)入水中，或者從空氣進(jìn)入玻璃。光路長(zhǎng)度與光線的傳輸時(shí)間和速度有關(guān)。光路長(zhǎng)度的差異導(dǎo)致光波穿過(guò)樣本的速度不同，即相移。因此，相位存在差異。與周圍介質(zhì)相比，較高的折射率會(huì)導(dǎo)致光波減速并降低相位。

干涉描述了兩道光波之間的相互作用，并按照疊加原則形成新的波形。光波干涉的相關(guān)參數(shù)是它們的振幅。如果兩道波相互干涉，生成光波的振幅等于每個(gè)干涉光波振幅的矢量和。

如果形成光波的振幅增大，這種干涉可以描述為相長(zhǎng)干涉（構(gòu)造性）。只要兩者的波峰和波谷在同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)相遇，就會(huì)出現(xiàn)這種情況。也有可能，一道光波的波峰與另一道的波谷在同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)相遇。這種情況會(huì)導(dǎo)致形成振幅較低的光波。這兩道光波之間的干涉稱為相消干涉（破壞性）。

相關(guān)顯微鏡的關(guān)鍵元件是環(huán)形光圈和相位板。環(huán)形光圈位于聚光鏡的前焦平面內(nèi)，限制了光波穿透的角度。相位板位于物鏡的后焦平面內(nèi)，搭配相差環(huán)，其材料可以按照λ/4的幅度調(diào)暗穿過(guò)相位板的光線，其中λ代表光線的波長(zhǎng)。

在采用科勒照明的相差顯微鏡^[5]中，不與樣本相互作用的光波在物鏡的后焦平面上聚焦為明亮的光環(huán)。光環(huán)沿光軸方向上與相差環(huán)形成空間匹配，引發(fā)未偏離光的相移。樣本衍射產(chǎn)生的光線并不照射在相差環(huán)上，因此不受影響。

受影響和未受影響的光波之間，可以形成λ/2的總相移。未偏斜光的相位在相差環(huán)處會(huì)提前λ/4，穿過(guò)生物樣本時(shí)的衍射或散射光波通常會(huì)延后λ/4。λ/2的總相移會(huì)令光波在圖像平面內(nèi)產(chǎn)生相消干涉。為了增強(qiáng)對(duì)比度，未偏斜光在穿過(guò)相差環(huán)時(shí)會(huì)變暗并且有一部分光線會(huì)被相差環(huán)吸收。一定要避免未偏斜光比偏斜光更加明亮的情況，因?yàn)槟菚?huì)降低對(duì)比度。

相差顯微鏡中觀察到的λ/2相移會(huì)產(chǎn)生的相消干涉效應(yīng)，因?yàn)楣獠ǖ牟ǚ搴筒ü仍谕粫r(shí)間點(diǎn)重合。因此，生成光波的振幅會(huì)減少，相位物體的相移轉(zhuǎn)換為振幅偏移。

相差分為兩種形式：正相差和負(fù)相差兩者的主要區(qū)別在于使用的相位板。對(duì)于正相差，穿過(guò)相差環(huán)的光線相比偏斜光會(huì)增加，對(duì)于負(fù)相差，相位會(huì)減少。負(fù)相差中的相位延遲會(huì)產(chǎn)生相位差異，導(dǎo)致光波受到破壞。光波存在相位，并引發(fā)相長(zhǎng)干涉，而非相消干涉，導(dǎo)致生成的光波振幅增加。

在正相差顯微鏡中，折射率高于周圍介質(zhì)的對(duì)象比折射率較低的對(duì)象顯得更暗。在負(fù)相差顯微鏡中，情況相反。

相差顯微鏡可以視覺(jué)呈現(xiàn)光線穿過(guò)樣本時(shí)的光路長(zhǎng)度差異。光路長(zhǎng)度與樣本的厚度和折射率有關(guān)。細(xì)胞膜和細(xì)胞器等細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)于光路長(zhǎng)度具有深遠(yuǎn)的影響。由于許多細(xì)胞（特別是細(xì)胞培養(yǎng)液中）具有扁平且規(guī)則的形狀，因此使用明場(chǎng)顯微鏡幾乎無(wú)法看到它們。

這種細(xì)胞相差圖像可以放大細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異，可以視為光致密圖，因?yàn)?strong>光密度對(duì)于樣本或樣品的折射率有很大影響。不過(guò)，多種效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致相差圖像的正確解釋變得復(fù)雜，因?yàn)樗鼈儾恢苯尤Q于光路長(zhǎng)度的差異。

光暈效應(yīng)可以描述大型相位物體周邊出現(xiàn)的正相差亮邊或負(fù)相差暗邊。光暈會(huì)形成是因?yàn)閬?lái)自樣本的部分衍射光會(huì)穿過(guò)相差環(huán)。未偏振波形成的光環(huán)要比相差環(huán)小一點(diǎn)，因此來(lái)自樣本的低空衍射光波可以穿過(guò)相差環(huán)。穿過(guò)相差環(huán)的偏斜光保持著90°的相差，因此不受干涉的影響。這會(huì)導(dǎo)致對(duì)比度反轉(zhuǎn)，導(dǎo)致大型物體的邊緣出現(xiàn)光暈。

遮光效應(yīng)是指樣本的均勻部分和周圍介質(zhì)一樣，以相同的光強(qiáng)度來(lái)顯示所發(fā)生的情況雖然穿過(guò)這些區(qū)域的光線會(huì)發(fā)生相移，但只有輕微的衍射，且散射角度大幅降低。因此，這些光波進(jìn)入相差環(huán)時(shí)，就像未偏斜光一樣，不會(huì)發(fā)生干涉。

相差顯微鏡的另一個(gè)問(wèn)題就是可能發(fā)生對(duì)比度反轉(zhuǎn)。如果折射率很高的物體旁邊是折射率較低的物體，它們就會(huì)顯得更加明亮，而不是更暗（正相差的原因）。在這些區(qū)域，相移不是生物樣本常見(jiàn)的λ/4，因此會(huì)出現(xiàn)相長(zhǎng)干涉，而不是相消干涉（這與負(fù)相差正好相反）。

雖然這些效應(yīng)會(huì)讓相差圖像在解讀時(shí)更加困難，但相差顯微鏡是一種簡(jiǎn)單且重要的光學(xué)對(duì)比成像技術(shù)，可以對(duì)相位物體成像。此外，相差顯微鏡能夠研究活體樣本中的細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)，因此是生物學(xué)研究中常用的光學(xué)對(duì)比法。