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PCR反應(yīng)被抑制或效率較低調(diào)整過(guò)程:
一旦確定反應(yīng)被抑制或效率較低，則可采取一些步驟將效率值重新調(diào)整到理想范圍內(nèi)。
1、對(duì)于抑制作用，可去除模板濃度最高的反應(yīng)孔并重新分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果效率重新回到110% 以下，則分析良好。
2、另一種解決方案是重新純化模板。切記應(yīng)延長(zhǎng)干燥時(shí)間，以去除乙醇沉淀過(guò)程中的乙醇，或采用另外的柱上洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。
3、通過(guò)分析優(yōu)化可解決效率低下的問(wèn)題。此過(guò)程有時(shí)相對(duì)簡(jiǎn)單，但在某些情況下，隨著分析復(fù)雜度的提高，優(yōu)化過(guò)程可能十分耗時(shí)費(fèi)力。
4、擴(kuò)增單個(gè)產(chǎn)物時(shí)，將鎂的濃度提升至6mM 可提高反應(yīng)效率，但當(dāng)出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)作用時(shí)，則應(yīng)降低鎂的濃度。
5、在某些情況下(主要是多重反應(yīng)中)，必須采用引物和探針優(yōu)化基質(zhì)。此時(shí)，需檢測(cè)正向引物與反向引物的比值或濃度，有時(shí)甚至還需檢測(cè)探針比值，以找出分析的理想濃度組合。最佳引物濃度介于100至600nM之間，而最佳探針濃度則在100nM至400nM 之間。
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