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海洋微生物調(diào)查技術(shù)要求和調(diào)查要素

技術(shù)要求

采樣站位和層次

a)站位布設(shè)應盡量和其他調(diào)查項目一致;

b) 采樣水層見表1,但可去除5 m水層;大洋調(diào)查可增加500 m.1 000 m.2 000 m.....等水層的采樣;

c) 海洋沉積物中微生物取樣層次,大面調(diào)查取表層;斷面調(diào)查時,將巖芯管以3cm間隔分層;對于特殊調(diào)查項目,可根據(jù)實際需要確定采樣層次。

無菌操作

a) 采水器上的采樣瓶、袋應預先滅菌;

b) 實驗室內(nèi)水.泥樣分樣和分離培養(yǎng)鑒定過程中,均按無菌操作要求進行;

c) 其他凡屬海上調(diào)查所需物品，如水樣貯存瓶(棕色)、移液管(1 cm*、5 cm*、10 cm')、培養(yǎng)皿等均需洗凈,包封滅菌、足量備用。

樣品保存

樣品應在采樣后2 h內(nèi)處理、分析。若暫放冰箱保存，不得超過24 h。

調(diào)查要素

海洋微生物調(diào)查要素為:海洋微生物現(xiàn)存量,即病毒、細菌總數(shù)與微生物其他類群(放線菌、酵母、霉.菌等)的豐度和海洋微生物的活性，即細菌生產(chǎn)力、微生物異養(yǎng)活性、生態(tài)呼吸率的測定。

采樣

主要儀器設(shè)備

采水器

根據(jù)采樣深度,選用尼斯金采水器或擊開式采水器。

采泥器

箱式采樣器、多管采樣器或彈簧采泥器,見小型底棲生物調(diào)查的采樣器。

采水樣

a)按實際情況選用采水器;

b) 采水器開啟后,應停留片刻,待水樣裝滿;

c) 按測定項目計算采水量,若同一水層分幾次采樣,樣品應混勻,再按各測定項目要求分裝、處理。

采泥樣

用無菌工具從預定層次中取10 g~20 g樣品,置于無菌容器。

樣品分析

主要儀器設(shè)備

熒光顯微鏡

具備藍光道和紫外光道供觀察吖啶橙和DAPI染色,配置照相機或高分辨率并適用于弱光場的數(shù)碼相機。

液體閃爍計數(shù)儀

具有測定"C和H的功能。

恒溫培養(yǎng)箱

具有測定"C和"H的功能。

恒溫培養(yǎng)箱

控溫范圍:5C~50C。

抽濾裝置

進口成品濾器組或自行裝配25mm和47mm濾器和負壓抽濾設(shè)備。放射性同位素示蹤測試的抽濾設(shè)備必須專用,不能與微生物計數(shù)混用。

移液槍

置備不同功用的移液槍。

微生物自動鑒定儀

現(xiàn)有的微生物鑒定儀器主要應用于醫(yī)學微生物鑒定,有條件的單位選用較適用于環(huán)境微生物鑒定的儀器產(chǎn)品。

消耗性材料

濾膜

a) 微孔濾膜(材料:醋酸纖維或硝化纖維):直徑25 mm和47 mm,孔徑0.2 μm、0.45 μm和0.8 μm;

b) 黑色核孔濾膜(材料:聚碳酸酯):直徑25 mm,孔徑0.2 μm;

c) 氧化鋁濾膜:直徑25 mm,孔徑0. 02 μm。

注射器和濾器

一次性和0.2μm無菌濾器。

熒光顯微鏡計數(shù)用的裝樣瓶

a)50cm3螺蓋聚丙烯瓶:用前用5%HCl溶液浸泡1d以上,并經(jīng)0.02μm濾膜過濾的蒸餾水漱洗并高壓滅菌;

b)50cm3螺蓋塑料瓶:用前用5%HCl溶液浸泡1d以上,并經(jīng)0.2um濾膜過濾的蒸餾水漱洗并高壓滅菌。

同位素示蹤培養(yǎng)瓶和閃爍計數(shù)瓶

a) 50 cm3螺蓋培養(yǎng)管;

b)125cm3螺蓋培養(yǎng)瓶;

c)20cm3或7cm’與閃爍儀匹配的玻璃或塑料閃爍瓶。

玻璃器皿

培養(yǎng)皿、BOD培養(yǎng)瓶和常用玻璃器皿。

培養(yǎng)基、試劑和工作溶液

培養(yǎng)計數(shù)用的培養(yǎng)基、試劑

陳海水

取天然海水避光保存3個月以上,使用時取其清液或經(jīng)0.45μm濾膜過濾的濾液。

表面活性劑.

將吐溫- 80(Tween-80)按體積分數(shù)為1 : 2 000比例配成水溶液(工作液)高壓滅菌備用。

樣品處理

水樣處理

外熒光直接計數(shù)的水樣

a) 病毒計數(shù):取水樣50 cm2于預先處理的采樣瓶中,加2.5 cm2(甲醛在樣品中的質(zhì)量濃度為2%)固定樣品,樣品應立即分析,否則應在4C避光保存,但只能保存一周。

b) 細菌計數(shù):取水樣50 cm2于預先處理的采樣瓶中,加2.5 cm2* (甲醛在樣品中的質(zhì)量濃度為2%)固定樣品,樣品于2C~8C低溫保存。濾膜萌發(fā)、平板計數(shù)的水樣按10cm3/dm'量加滅菌的吐溫一80工作溶液。

細菌生產(chǎn)力水樣

a)[甲基-3H]胸腺嘧啶核苷示蹤水樣取3支50 cm2帶螺蓋培養(yǎng)管,各加入20 cm2水樣,其中- -管加1 cm°甲醛混勻為對照,再向各管加人[甲基~H]胸腺嘧啶核苷工作溶液，使其終濃度為250 nmol/dm°(即加入1 cm3 該示蹤劑的工作溶液),混勻,置現(xiàn)場溫度培養(yǎng)1 h,再加人1 cm2甲醛于測樣瓶中搖均,以終止培養(yǎng)并保存于冰箱。對活性較低的水體,應適當延長培養(yǎng)時間。

b) [2 H]示蹤水樣用[4,5-3 H]代替[甲基-3 H]胸腺嘧啶核苷,使其在樣品中的最終濃度為20 nmol/dm2 (即加20 mm示蹤劑于20 cm樣品中),其余步驟同上。

微生物異養(yǎng)活性測定的水樣

取3個125 cm3帶螺蓋三角瓶,各加入100cm3水樣,其中1瓶加入5cm2作對照,再向各瓶加入D-[UL-"C]葡萄糖工作溶液1 cm3 ,蓋緊混勻，置現(xiàn)場水溫暗培養(yǎng)1 h后,加入5 cm3甲醛于測樣中,搖勻以終止培養(yǎng)。

生態(tài)呼吸率測定水樣

將水樣按溶解氧測定要求注入4個250 cm2* BOD培養(yǎng)瓶中,其中2瓶立即固定,另2瓶置暗處于現(xiàn)場水溫條件下培養(yǎng)1d后,取出固定。對寡營養(yǎng)水體的樣品應適當延長培養(yǎng)時間。

泥樣處理

微生物計數(shù)泥樣取約2 g泥樣,精確稱重后,置于裝有含吐溫一80(10 cm*/dm3)的18 cm3海水并加玻璃珠的無菌三角瓶中,充分播蕩,制成懸浮液。

測定干重泥樣

保存余下的泥樣供測干重。

記錄

將以上結(jié)果分別記錄于表。

樣品分析

水樣微生物計數(shù)

微生物計數(shù)包括針對總菌數(shù)的“直接計數(shù)”和針對可培養(yǎng)微生物的“培養(yǎng)計數(shù)”。“直接計數(shù)”采用落射熒光顯微鏡,有條件的應采用流式細胞儀。

熒光顯微鏡直接計數(shù)

SYBR Green I直接計數(shù)法

適用于測定病毒總數(shù)。也可同時測定細菌總數(shù),但在病毒顆粒分布的視野中,細菌數(shù)偏少,且制片操作步驟繁瑣、氧化鋁濾膜價格目前是核孔濾膜的4倍。其工作程序如下:

a)濾器裝配:長期未用的濾器應先裝好濾器和抽濾裝置,用經(jīng)0.02μm過濾的高壓滅菌蒸餾水加滿濾簡并抽濾清洗2次或3次,(當天使用的濾器,在各個樣品測定前用同樣方法清洗一次，清洗時不必取下襯墊濾膜),再卸下濾筒在濾板上先放置孔徑為0. 45 pμm或0.8 μm的25 mm微孔濾膜作襯底(襯底可多次使用);然后將孔徑為0.02 μm氧化鋁濾膜放于襯墊上,再裝配.好濾筒;

b)配制染色劑:臨用前,取出SYBRGreenI儲備液(6.3.2.2.2a)),用經(jīng)0.02μm過濾的無菌去離子水按1:10稀釋(如加5mm'儲備液到45mm’稀釋水中),操作必須在弱光環(huán)境中進行，未用完的儲備液應立即放回一20C冰箱避光保存;

c) 配制熒光保護劑工作液:臨用前取10% p-苯二胺儲備液(6.3.2.2.2 b))、化霜、播勻后,吸取10 mm3與990 mm'PBS甘油儲備液(6.3.2.2.2 b))混合,制成工作液,該工作液應避光、置冰浴,未用完的10% p-苯二胺儲備液應立即再行冷凍,但該儲備液管累計凍、融3次后,便須丟棄;如果p-苯二胺儲備液或熒光保護劑工作液呈棕色,棄之不用并重新配制;

d) 加樣:加入適量樣品(1 cm'~10 cm3，即視野病毒數(shù)控制在50個左右),若樣品量少于1 cm3則應先加入2 cm°經(jīng)0. 02 μm過濾的無菌海水,再加樣,以便病毒、細菌均勻分布于濾膜上;

e) 抽濾:在負壓(15 kPa~20 kPa)條件下,把樣品抽濾至干,卸下濾筒;

f) 染色:吸取97.5 mm3經(jīng)0.02 μm過濾的無菌去離子水,滴人干凈的無菌塑料培養(yǎng)皿,再向該水滴加入2.5 μL 10% SYBR Green I染色劑工作液(此時,染色劑濃度為0. 25%),培養(yǎng)皿及染色劑需置于冰浴、避光處;用扁平頭鑷子在負壓狀態(tài)下,取下載有樣品的氧化鋁濾膜,將膜的背面(非載樣面)放在培養(yǎng)皿的染色液滴上冰浴、避光染色15min;

g) 制片:染色后,取出濾膜,吸干貼上濾膜背面及邊緣的液滴,把濾膜緊貼于載玻片上(載樣面朝上),并在蓋玻片上加30 mm°熒光保護劑工作液,具液面朝下蓋緊濾膜(濾膜上下兩面均不能有氣泡),用指甲油密封蓋玻片四周,制片在一20C條件下可保存2周~3周,但以立即計數(shù)為宜;

h)計數(shù):在熒光顯微鏡藍色激發(fā)光道、油鏡條件下，病毒顆粒呈針扎(pinprick)狀、亮綠色,細菌細胞亦呈亮綠色,但其亮度強于病毒顆粒,且菌體比病毒顆粒大得多。隨機取10個~20個視野,計算病毒顆粒數(shù)(如果要同時計算細菌數(shù)的話,還需計算具有細菌形態(tài)的細胞數(shù)),每個樣品至少計數(shù)200個病毒(或細菌);

i) 每次(不同測定日期)測定時,應加測不加樣品的空白對照,對于空白制片,每個視野不得出現(xiàn)1個以上病毒(或細菌)。

j)計算樣品含病毒顆粒數(shù)

吖啶橙直接計數(shù)法

適用于測定細菌總數(shù)，工作程序如下:

a)濾器裝配:長期未用的濾器應先裝好濾器和抽濾裝置,用經(jīng)0.2μm過濾的高壓滅菌蒸餾水加滿濾簡并抽濾清洗2次或3次,(當天使用的濾器,在各個樣品測定前用同樣方法清洗-一次,清洗時不必取下襯墊濾膜),再卸下濾簡在濾板上先放置孔徑為0.8μm或0.45 μm的25 mm微孔濾膜作襯底(襯底可多次使用);然后將黑色核孔濾膜(光滑面朝上)放于襯墊上,再裝配好濾筒;

b) 加樣:加人適量樣品(控制在視野出現(xiàn)菌體50個左右),若樣品量少于1 cm’則應先加人2 cm3經(jīng)0.2 μm過濾的無菌海水,再加樣,以便細菌均勻分布于濾膜上;

c)抽濾:在負壓(50kPa)條件下,把樣品抽濾至濾膜剛好呈濕潤狀態(tài),并釋放真空;

d) 染色:用吸取吖啶橙工作液,套上0.2 pμm無菌濾器,沿濾筒壁加入約1 cm3染色液，使其蓋滿濾膜并染色5 min~10 min。而后在同樣負壓下抽濾至干;

e) 制片:在載玻片上加一小滴無熒光鏡油,貼上濾膜(載菌一面朝上),并在蓋玻片上加一小滴同樣鏡油,具油面朝下蓋緊濾膜(濾膜上下兩面均不能有氣泡),用指甲油密封蓋玻片四周,制片在一20C條件下可保存數(shù)月,但以立即計數(shù)為宜;

f)計數(shù):在熒光顯微鏡藍光道,油鏡條件下,隨機取10個視野,計算具有細菌形態(tài)呈亮綠色的細胞數(shù);每個樣品至少計數(shù)300個菌體;每次(不同測定日期)測定時,應加測不加樣品的空白對照,空白制片,每個視野不得出現(xiàn)1個以上細菌;

 DAPI直接計數(shù)法

適用于測定細菌總數(shù),和吖啶橙染色法相比,背景更清晰,熒光色素干擾較少,菌體著色不易衰減但需要用紫外光激發(fā)濾光系統(tǒng)(即:G 365激發(fā)濾光片,FT 395分射濾光片,LP 420吸收濾光片)的顯微鏡觀察。其工作程序除了用DAPI工作溶液(即:10 ug/cm2)代替吖啶橙染色液外,其余步驟均相同。當本計數(shù)法與吖啶直接計數(shù)法的計數(shù)結(jié)果有異議時,以本計數(shù)法為仲裁計數(shù)法。

細菌體積測定一顯微攝影、幻燈測量法

細菌生物量(以C計)與細菌個體大小相關(guān)。通過測定細菌體積并借助于經(jīng)驗轉(zhuǎn)換系數(shù),把細菌轉(zhuǎn)化為細菌生物量。已有許多方法應用于測量細菌體積,數(shù)碼攝像并帶影像自動分析軟件系統(tǒng)屬較的技術(shù),需要大資金的設(shè)備投入,而顯微攝影- -一幻燈測量法系普 及型技術(shù),具體工作程序如下:

a) 膠卷安裝和系統(tǒng)測試:選用ASA 400彩色反轉(zhuǎn)片膠卷,按顯微攝影要求操作,并通過測試比較,選擇適當?shù)钠毓饨M合;

b) 樣品拍照:在熒光計數(shù)時,選擇5個~10個菌數(shù)較多的視野,進行拍照，以便在照片上獲得足夠多的菌體。同時記錄照片序號和相對應的樣品號;

c)標尺拍照:在與細菌直接計數(shù)相同放大倍數(shù)條件下,利用顯微鏡普通光系統(tǒng),清晰地拍照臺圍尺標度;

d) 制備幻燈投影:沖洗拍照的膠卷, 制成幻燈片,裝人幻燈機,投影于貼白紙的墻壁上;

e) 菌體測量:用游標卡尺測量幻燈投影臺微尺的長度,注意測量不同部位的長度,以便獲得統(tǒng)計平均值。選擇輪廓清晰的菌體,測量其長度和寬度,并作記錄。每測完一個菌體,應立即作標記,以防重復測量;

f)細菌體積計算:先根據(jù)臺微尺刻度實際長度和幻燈投影上測量長度的放大比例,計算出被測細菌實際長度和寬度,然后按下述公式,計算細菌體積;

培養(yǎng)計數(shù)法

濾膜萌發(fā)計數(shù)法

適用于測定微生物活菌數(shù),多用于水深大于200 m的海區(qū)。工作程序如下:

a) 濾膜處理:使用前, 微孔濾膜(孔徑0.2 pm,直徑47 mm)用鋁箔紙包好,高壓滅菌;

b) 濾器裝配:不用加襯墊;

c) 加樣:加適量樣品(以每片濾膜出現(xiàn)30個~50個左右的菌落為宜),若加樣量少,應添加適量高壓滅菌海水稀釋;用于放線菌.酵母.霉菌計數(shù)的樣品，加樣量應略大;每個樣品一般取兩種過濾量，每種過濾量重復三片濾膜;

d) 抽濾:;

e) 培養(yǎng):將濾膜粗糙面(即:沒有載濾物的一面)緊貼于備好的平板培養(yǎng)基上(濾膜和培養(yǎng)基間不得有氣泡),將平板倒置于接近樣品現(xiàn)場溫度的恒溫箱培養(yǎng)4d~15d;

f)計數(shù):在放大鏡下或用菌落計數(shù)器,按菌落形態(tài)，分別計算各種培養(yǎng)基中四大菌類的菌落數(shù)(必要時,用顯微鏡觀察確證);

g)計算樣品含菌數(shù)

微生物分類鑒定

條件許可時應進行微生物分類鑒定。

菌種分離、純化和保存

用接種針從微生物培養(yǎng)計數(shù)的平板或濾膜上挑取全部菌落或部分區(qū)域的所有菌落,挑取時注意選擇形態(tài)特征不同的菌落,挑取的菌落在新平板上反復劃線分離,培養(yǎng)數(shù)天,選取新形成的單菌落,直至純種,再接于斜面培養(yǎng),長成后置冰箱保存待鑒定;如果不是純種,應繼續(xù)純化。

種類鑒定

種類鑒定方法包括傳統(tǒng)鑒定法、儀器自動鑒定法和分子生物學鑒定法。

菌種保藏

對一些有代表性或有保存價值的菌種,按菌種保藏法的要求，登記入庫,長期保存。

資料整理

利用計算機保存分析、計算數(shù)據(jù)、制作報表、繪制分布圖。

填寫報表

按本部分的有關(guān)規(guī)定填寫。

分別將病毒、細菌、放線菌、酵母菌和霉菌的數(shù)量(包括細菌生物量)以及細菌生產(chǎn)力和細菌異養(yǎng)活性的測定結(jié)果。

繪制分布圖

斷面分布圖

一般以等值線表示,取值標準視具體情況而定。

a)微生物數(shù)量和細菌生物量斷面分布圖;

b)細菌生產(chǎn)力斷面分布圖;

c)微生物異養(yǎng)活性斷面分布圖;

d)生態(tài)呼吸率斷面分布圖。

大面分布圖

一般以等值線表示,取值標準視具體情況而定。

a)微生物數(shù)量和細菌生物量大面分布圖;

b)細菌生產(chǎn) 力大面分布圖;

c)微生物異養(yǎng)活性大面分布圖;

d)生態(tài)呼吸率大面分布圖。