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PCR全稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction），是一種非常強(qiáng)大的技術(shù)，可以通過一種非常簡單但是高效的方法來復(fù)制DNA，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。那PCR反應(yīng)準(zhǔn)備工作要怎么做呢?
1.PCR反應(yīng)體系

• 1.10×擴(kuò)增緩沖液 10μl

• 2.4種dNTP混合物（終濃度） 各100～250μmol/L

• 3.引物（終濃度） 各5～20μmol/L

• 4.模板DNA 0.1～2μg

• 5.Taq DNA聚合酶 5～10 U

• 6.Mg2+（終濃度） 1～3mmol/L

• 7.補(bǔ)加雙蒸水 100 μl

其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整，以上數(shù)據(jù)僅供大致參考值。
PCR反應(yīng)五要素：

• 1.引物：(PCR引物為DNA片段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）引物有多種設(shè)計(jì)方法，由PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定，但基本原則相同。

• 2.酶：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇。

• 3.dNTP包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP

• 4.模板：模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來源，但有兩個(gè)原則，第一純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。

• 5.緩沖液：（其中需要Mg2+）

               緩沖液的成分最為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：
               緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；
               一價(jià)陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；
               二價(jià)陽離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；
               輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。

2.PCR引物設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。

1. 引物設(shè)計(jì)的基本原則

• 1.引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

• 2.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

• 3.引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。

• 4.兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。

• 5.引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有wan全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

• 6.引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，選擇是G和C。

• 7.引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生wu素、熒光物質(zhì)、di高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

3.模板的制備PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、毛發(fā)等。

標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶jun酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、lv仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。

4.反應(yīng)的控制

1. 1.PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子

2. 2.鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L

3. 3.底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L

4. 4.TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）

5. 5.引物 濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L

6. 6.反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)

• 變性溫度和時(shí)間 95℃，30s

• 退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃

• 延伸溫度和時(shí)間 72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）

• Tm值=4(G+C) +2(A+T)

循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”
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