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Science綜述 | 深入揭秘空間組學(xué)革命，未來科學(xué)新篇章將展開！

來源：北京澤匯商貿(mào)有限公司 2023年09月27日 13:04

在生物體中，細(xì)胞必須在三維組織中相互作用和組裝。每個(gè)細(xì)胞的位置與其內(nèi)在性質(zhì)一樣重要，可以用來確定組織在疾病中的功能或障礙。最近，在多重空間分子測量方面爆發(fā)的創(chuàng)新正在開啟生物學(xué)研究的新篇章，并使人們重新?lián)肀到y(tǒng)的復(fù)雜性。

空間組學(xué)有望通過同時(shí)測量物理組織結(jié)構(gòu)和分子特征，來改變生物學(xué)的許多領(lǐng)域并最終che底改變病理學(xué)。目前，大量新技術(shù)可以對(duì)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)、基因突變、表觀遺傳標(biāo)記、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因組組織進(jìn)行空間分析。但空間組學(xué)技術(shù)的分辨率、靈敏度和通量水平截然不同，在易于采用、與不同樣品類型的兼容性、商業(yè)可用性、前期投資和每個(gè)樣品的成本方面也存在很大差異。在這個(gè)不斷發(fā)展的領(lǐng)域，選擇zuihao的技術(shù)來解決特定的生物挑戰(zhàn)至關(guān)重要。

8月4日，劍橋大學(xué)科學(xué)家在《Science》撰寫題為“The dawn of spatial omics”的綜述文章，全面梳理了空間組學(xué)技術(shù)的豐富種類，闡明它們各自的原理、優(yōu)勢和局限性，并就空間組學(xué)目前面臨的挑戰(zhàn)提供了見解。

zui薪一代空間組學(xué)分析工具

1. 多重抗體成像

免疫組織化學(xué)（IHC）和原位雜交（ISH）方法已使用50多年。空間組學(xué)技術(shù)可以使用質(zhì)譜（MS）等非顯微方法來檢測分析物，執(zhí)行染色和染料去除循環(huán)以達(dá)到所需的復(fù)雜性，或者利用高通量DNA測序和條形碼的力量。

更新的質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（MC），基于與同位素純鑭系金屬綴合的抗體檢測，具有非常高的信噪比（SNR），是成像質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（IMC）和多重離子束成像（MIBI）的基礎(chǔ)。然而受到足夠純金屬的可用性的限制，可實(shí)現(xiàn)的復(fù)雜性在大約50個(gè)物種。

多重抗體成像的另一種方法是基于在重復(fù)成像周期中檢測常規(guī)標(biāo)記的熒光抗體。在部分方法中，所有抗體立即與樣品結(jié)合，并通過二級(jí)探針循環(huán)進(jìn)行檢測。總的來說，它們相對(duì)于MS具有更大的數(shù)據(jù)生成能力。對(duì)于涉及大量樣本收集的項(xiàng)目來說，循環(huán)成像方法可能是最可行的替代方案。

2. 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）和基因組學(xué)

這系列技術(shù)的最終目標(biāo)是，以亞細(xì)胞分辨率測量整個(gè)組織樣本中每個(gè)基因和基因亞型的豐度。目前，還沒有任何技術(shù)能夠達(dá)到這一目標(biāo)?？臻g基因組分析基于四種主要策略。

2.1 顯微切割和光隔離

顯微切割可能是通過物理分離從特定區(qū)域純化生物分子，來為分子圖譜添加空間信息的蕞明顯方法。激光捕獲顯微切割（LCM）通常用于分離小區(qū)域（數(shù)十至數(shù)百個(gè)細(xì)胞）以進(jìn)行RNA-seq，并且可以達(dá)到單細(xì)胞分辨率。

最近的研究使用光來空間選擇要剖析的區(qū)域。光可用于觸發(fā)逆轉(zhuǎn)錄（RT），切割報(bào)告基因，貼上純化標(biāo)記，或去除測序接頭連接的阻礙物（adaptor）。光還可以觸發(fā)DNA條形碼或條形碼組合的附著，通過驅(qū)動(dòng)其交聯(lián)或雜交到組織。然后使用條形碼將讀取重新分配給這些區(qū)域。

顯微切割技術(shù)能提供非常深入的分析，幾乎達(dá)到批量測序水平，并允許將感興趣的區(qū)域從單個(gè)細(xì)胞定制到整個(gè)區(qū)域。但是它們的通量相對(duì)較低。

2.2 多循環(huán)原位雜交

循環(huán)雜交的方法是單分子FISH（smFISH）的后代，這是一組將組織中的單個(gè)mRNA分子解析為亞衍射熒光點(diǎn)的技術(shù)。為了實(shí)現(xiàn)檢測，需要將多個(gè)探針與相同的mRNA分子結(jié)合。smFISH通常被認(rèn)為是RNA定量方法中的“金標(biāo)準(zhǔn)”，因?yàn)樗梢詸z測非常低豐度的轉(zhuǎn)錄本，從它衍生的空間分析技術(shù)往往具有出色的靈敏度。

MERFISH和seqFISH+是目前可用的兩種主要的基于雜交的原位轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，都已擴(kuò)展到全轉(zhuǎn)錄組水平，成功用于研究不同器官和組織中的空間基因表達(dá)，適合通過寡聚抗體同時(shí)檢測mRNA和蛋白質(zhì)。兩者在靈敏度、通量和優(yōu)缺點(diǎn)方面實(shí)際上非常相似，但在操作和條形碼方案細(xì)節(jié)方面存在一些技術(shù)差異。

還有其他一些技術(shù)如osmFISH、Saber-FISH、Clamp-FISH、SCRINSHOT、EEL-FISH等，其中許多方案可同時(shí)分析數(shù)千個(gè)基因和數(shù)十種蛋白質(zhì)。技術(shù)復(fù)雜且實(shí)施起來費(fèi)力，限制了該類技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

2.3 原位測序

該方法系列的前提是，對(duì)組織切片內(nèi)原位執(zhí)行高通量測序，蕞常用的測序技術(shù)是連接測序而不是合成測序。共同步驟是通過對(duì)檢測到的轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的圓形模板進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增（RCA），來生產(chǎn)DNA“納米球”（rolony）。每個(gè)mRNA分子都會(huì)產(chǎn)生一個(gè)單獨(dú)的rolony，從而可以對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量，蕞大讀取長度約為30個(gè)核苷酸。

這些方法包括基于與mRNA雜交的掛鎖DNA探針的ISS，和通過cDNA分子的環(huán)化產(chǎn)生RCA擴(kuò)增子的FISSEQ，它們也迅速催生了多種具有更高效率和改進(jìn)特征的衍生方法，如BaristaSeq。最近，均已與擴(kuò)展顯微鏡化學(xué)相結(jié)合，效率和SNR均得到了顯著提高，如ExSeq。

基于FISH和基于原位測序的方法有一個(gè)共同點(diǎn)：最終通過組織的高分辨率顯微鏡成像進(jìn)行檢測，并通過有效計(jì)數(shù)單個(gè)mRNA分子來測量基因表達(dá)。單分子顯微鏡非常具有挑戰(zhàn)性，需要極其精確的儀器和進(jìn)程，檢測靈敏度也會(huì)因細(xì)胞大小而產(chǎn)生偏差。

2.4 空間條形碼

在ST中，通過使用微陣列打印技術(shù)，將有序的寡核苷酸陣列沉積在載玻片上，然后將薄的組織切片放置在陣列上，進(jìn)行透化以使細(xì)胞RNA擴(kuò)散到帶有條形碼的寡核苷酸，并原位反轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生空間索引的cDNA，然后產(chǎn)生文庫并進(jìn)行測序。關(guān)鍵優(yōu)勢是能夠產(chǎn)生長測序讀數(shù)、不依賴復(fù)雜的成像儀器、高速、用于并行化，極大地促進(jìn)了其商業(yè)應(yīng)用。然而，也存在一些缺點(diǎn)，包括分辨率低（目前為50至100 μm）、每個(gè)樣品的成本高以及RNA捕獲效率低。

Slide-seq和HDST技術(shù)將帶有條形碼的Poly（T）引物附著到納米珠上，然后將珠子包裝在粘性載玻片（Slide-seq）或微孔圖案載玻片（HDST）上，達(dá)到更高的空間密度（Slide-seq為10 μm，HDST為2 μm）。Slide-seq、HDST和Slide-tags能夠以與單細(xì)胞大小相當(dāng)?shù)姆直媛蔬M(jìn)行分析，但這是以更復(fù)雜的操作和試劑設(shè)置以及更低的RNA捕獲效率為代價(jià)的。改進(jìn)方法如Seq-Scope、Stereo-seq和PIXEL-seq都具有相對(duì)較高的捕獲效率，與scRNA-seq持平或略高。此外，還有DBIT-seq。

空間條形碼技術(shù)與批量測序相結(jié)合非常成功。商業(yè)選項(xiàng)的可用性、高精度儀器的不依賴以及與現(xiàn)有工作流程的兼容性降低了進(jìn)入門檻，數(shù)據(jù)分析也相當(dāng)簡單。然而，空間條形碼相對(duì)于樣本的低分辨率和隨機(jī)定位意味著信息有時(shí)會(huì)混淆結(jié)果。

選擇的平衡

方法的選擇取決于每個(gè)特定研究的具體需求，分辨率、通量、易于實(shí)施、穩(wěn)健性和成本是關(guān)鍵變量。

對(duì)于蛋白質(zhì)分析，主要決定是投資IMC-MIBI生態(tài)系統(tǒng)還是選擇環(huán)狀免疫熒光方案。IMC的分辨率相對(duì)較粗，通常不足以檢測細(xì)胞核和膜以外的任何亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。MIBI提供更高的分辨率，但處理速度更慢。環(huán)狀免疫熒光成本較低，提供更高的通量，辨率要高得多，具有較低的SNR。

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域的考慮要復(fù)雜得多。基于成像的方法可以提供非常高的分辨率，但這也使它們變慢。雜交方法具有更好的靈敏度，但往往會(huì)產(chǎn)生較弱的熒光信號(hào)，還需要針對(duì)不同的組織重新優(yōu)化，在相對(duì)較薄的切片（10至20μm）上表現(xiàn)蕞佳。而原位測序方法可以對(duì)更厚的樣品（高達(dá)100μm左右）進(jìn)行成像，但表現(xiàn)出蕞低的靈敏度。

分辨率和通量也是某些基于條形碼的方法需要考慮的關(guān)鍵參數(shù)。在大多數(shù)情況下，這些方法無法將空間條形碼與特定細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。目前使用蕞廣泛的技術(shù)ST，其分辨率較低，使得詳細(xì)分析空間鄰域變得更加困難。此外，靈敏度相對(duì)較低，并且每個(gè)樣品的成本通常高于其他方法。然而，條形碼方法在通量方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢。

當(dāng)只需要對(duì)幾個(gè)空間位置進(jìn)行深度剖析時(shí)，應(yīng)考慮激光捕獲解剖或空間標(biāo)記方法。這些方法通常更容易實(shí)現(xiàn)，并且可通過各種批量分析方法直接純化選定材料進(jìn)行分析。

兩大挑戰(zhàn)

1. 分析的挑戰(zhàn)：從大數(shù)據(jù)到有用數(shù)據(jù)

數(shù)據(jù)采集通常被認(rèn)為是空間組學(xué)方法中最困難的步驟，但數(shù)據(jù)操作、分析和可視化同樣重要。圖像配準(zhǔn)是一個(gè)難題，巨大數(shù)據(jù)量使空間分析變得更加復(fù)雜。大多數(shù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法需要解碼步驟，這些處理難以標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化。最近，SpaceTx聯(lián)盟做出了巨大的努力，發(fā)布了一組成功適用于大多數(shù)方法的Python模塊——Starfish。

圖像分割是生物成像和計(jì)算機(jī)視覺的核心問題，并且在過去幾年中受益于人工智能（AI）和深度學(xué)習(xí)的快速發(fā)展。定義細(xì)胞質(zhì)膜邊界是一項(xiàng)更復(fù)雜的任務(wù)，即使使用AI模型也無法產(chǎn)生有效的分割。

空間條形碼方法繞過了大多數(shù)圖像分析要求，但條形碼讀數(shù)映射到的“位置”不一定對(duì)應(yīng)于特定的單個(gè)細(xì)胞。為分解數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)的工具可以提供良好的結(jié)果，如Seurat、ScateR、Scanpy和Monocle軟件包，但數(shù)據(jù)生成的細(xì)微差別可能會(huì)導(dǎo)致偏差。專用軟件包通常將原始數(shù)據(jù)的直接可視化與逐個(gè)特征矩陣的分析相結(jié)合，還提供商業(yè)選項(xiàng)，例如，GiottoVitesSce、Histocat、Cytomapper、SquidPy等。

盡管目前的工具能對(duì)空間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，但無法有效利用空間剖析方法最重要的特征：空間。可以通過配體-受體分析來補(bǔ)充，這是一種在分解的scRNA-seq中引入的細(xì)胞-細(xì)胞功能相互作用的測量方法。

2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的挑戰(zhàn)

一種應(yīng)用是在生理和病理?xiàng)l件下識(shí)別組織內(nèi)的新細(xì)胞類型和狀態(tài)。這是人類細(xì)胞圖譜項(xiàng)目公開的目標(biāo)，該項(xiàng)目現(xiàn)在正轉(zhuǎn)向空間組學(xué)技術(shù)。這些方法可以揭示傳統(tǒng)細(xì)胞類型定義未解釋的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的殘余異質(zhì)性，并將其與空間位置相關(guān)聯(lián)。另一個(gè)問題是不同細(xì)胞類型的共定位，是否影響表達(dá)譜或與組織功能或疾病結(jié)果相關(guān)。這是最近幾個(gè)大型項(xiàng)目的重點(diǎn)，例如研究腫瘤如何進(jìn)化以及對(duì)治療的反應(yīng)。同時(shí)分析許多基因和蛋白質(zhì)的能力也有助于發(fā)現(xiàn)特定空間生態(tài)位的新標(biāo)記。

使用空間組學(xué)方法來表征細(xì)胞類型的一個(gè)挑戰(zhàn)是在每個(gè)位置測量的特征數(shù)量有限。克服這一限制的一種策略是，將空間測量與分解的單細(xì)胞方法相結(jié)合。

重復(fù)是該領(lǐng)域大部分的核心問題。當(dāng)研究具有刻板組織的樣本時(shí)，獲取多個(gè)重復(fù)并平均結(jié)果相對(duì)簡單，但這對(duì)于具有高度異質(zhì)且不一致的空間結(jié)構(gòu)的病理組織來說是一個(gè)挑戰(zhàn)。更復(fù)雜的是，隨著數(shù)據(jù)分辨率的提高，即使在具有看似可重復(fù)結(jié)構(gòu)的組織中，樣品之間的異質(zhì)性也暴露出來。

未來展望

我們?nèi)蕴幱诳臻g組學(xué)時(shí)代的黎明。隨著時(shí)間的推移，空間分析方法將變得更快、更可靠、更強(qiáng)大。這可能會(huì)與更廣泛的商業(yè)儀器和試劑同時(shí)提供。

剖析深度可能會(huì)繼續(xù)增加，現(xiàn)有技術(shù)將進(jìn)一步擴(kuò)展到更廣泛的測量范圍，基因組和表觀基因組測量也越來越多地在空間上進(jìn)行，空間多組學(xué)技術(shù)將興起，模仿分解的單細(xì)胞技術(shù)的演變。最后，該領(lǐng)域?qū)⒏咏嬲?/strong>3D輪廓。

空間組學(xué)已經(jīng)為多個(gè)領(lǐng)域提供了實(shí)質(zhì)性和多樣化的見解，包括動(dòng)物發(fā)育和大腦結(jié)構(gòu)以及與患者結(jié)果相關(guān)的腫瘤微環(huán)境（TME）特征。我們正處于空間組學(xué)革命的開端，但進(jìn)展正在以驚人的速度發(fā)生，也將為闡明許多生物學(xué)問題做出重大貢獻(xiàn)。

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