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       細(xì)胞可根據(jù)其局部微環(huán)境改變機(jī)械特性，這與決定細(xì)胞功能有關(guān)，甚至可以影響干細(xì)胞情況。美國研究人員Ming Guo等確定了細(xì)胞硬度和細(xì)胞體積之間具有穩(wěn)定且統(tǒng)一的關(guān)系。當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上鋪展時(shí)，它的體積減小，而硬度隨之增加。細(xì)胞皮質(zhì)和胞質(zhì)硬度會因各種擾動而隨體積變化，包括不同的基質(zhì)硬度、細(xì)胞鋪展面積和外部滲透壓變化。細(xì)胞體積減少是水流出的結(jié)果，這也導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)分子擁擠程度相應(yīng)增加。此外，細(xì)胞體積變化進(jìn)而硬度變化會改變干細(xì)胞分化。這些結(jié)果揭示了細(xì)胞硬度和細(xì)胞體積間不可思議的關(guān)系，對細(xì)胞生物學(xué)具有深遠(yuǎn)影響。文章以“Cell volume change through water efflux impacts cell stiffness and stemcell fate”為題發(fā)表于PNAS。

背景

       細(xì)胞體積是一個(gè)高度受調(diào)控的特性，它會影響無數(shù)功能，會隨著細(xì)胞生命循環(huán)發(fā)生改變，會隨著細(xì)胞質(zhì)膜生長、蛋白、DNA及其它包內(nèi)物質(zhì)的增加而增加。當(dāng)細(xì)胞通過有限空間遷移時(shí)，細(xì)胞體積也會發(fā)生快速變化，此時(shí)體積變化是水運(yùn)輸?shù)桨鈱?shí)現(xiàn)的。而這種快速變化會導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)及分子擁擠，從而產(chǎn)生諸多嚴(yán)重影響。通過施加外部滲透壓可迫使水流出細(xì)胞，直接使細(xì)胞體積減少，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)濃度增加，分子擁擠度增加。此外還會改變細(xì)胞力學(xué)，導(dǎo)致硬度增加、影響蛋白折疊和運(yùn)輸以及染色質(zhì)凝聚。這種滲透壓引發(fā)的體積變化對細(xì)胞行為產(chǎn)生的巨大影響促生了一個(gè)問題，即等滲情況下，細(xì)胞是否會通過水外流改變體積，通過改變分子擁擠度來調(diào)節(jié)力學(xué)及行為。

       本研究證明了當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)于相同的等滲條件時(shí)，如胞外環(huán)境較硬，細(xì)胞會通過水外流減少細(xì)胞體積，這對細(xì)胞力學(xué)和細(xì)胞生理有巨大影響。當(dāng)一個(gè)細(xì)胞在堅(jiān)硬基質(zhì)上鋪展開時(shí)，它體積減少，細(xì)胞行為與施加了外部滲透壓的細(xì)胞類似，即隨著細(xì)胞體積減小，皮質(zhì)和胞質(zhì)硬度增加，而細(xì)胞核體積也隨細(xì)胞體積減小而減小。此外干細(xì)胞分化受細(xì)胞體積變化的影響也很強(qiáng)烈。這些結(jié)果表明不同環(huán)境下的細(xì)胞可通過水外流來改變體積，引發(fā)胞內(nèi)分子擁擠度變化并影響細(xì)胞力學(xué)、生理及行為，對細(xì)胞命運(yùn)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

結(jié)果

01-施加外部滲透壓情況下，細(xì)胞體積模量和剪切模量隨細(xì)胞體積減小而增加

       通過添加300Da聚乙二醇（PEG300）控制外部滲透壓，直接探索細(xì)胞體積變化的后果。熒光標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞表面測量細(xì)胞體積，共聚焦顯微鏡以3D模式識別細(xì)胞邊界。細(xì)胞饑餓一夜后成像以消除自然細(xì)胞周期變化影響。測量體積與已有原子力顯微鏡（AFM）測量體積一致。同一樣品將共聚焦測量結(jié)果與高分辨率結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)（SIM）測量結(jié)果比較，作進(jìn)一步驗(yàn)證。兩種技術(shù)測得的細(xì)胞體積一致，表明測量不確定度< 10%（圖S1）。

       為探索細(xì)胞體積對外部滲透壓的依賴性，在玻璃基底上培養(yǎng)A7細(xì)胞，并向培養(yǎng)基中加入濃度逐漸增加的PEG 300，由于PEG 300不穿透細(xì)胞膜，因此實(shí)現(xiàn)外部滲透壓增加。由于滲透壓對細(xì)胞皮質(zhì)平衡的影響可以忽略不計(jì)，而胞內(nèi)滲透壓由離子和小蛋白質(zhì)的濃度控制。因此為了補(bǔ)償外部滲透壓的增加，細(xì)胞必須通過離子流入或水流出來增加其內(nèi)部滲透物濃度。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積隨著外部滲透壓的增加而減少（圖S2），去除外部滲透壓后細(xì)胞體積恢復(fù)到原始值，因此這是水流出引起的。細(xì)胞在jiduan滲透壓下最終可達(dá)最小體積（圖S2）；這反映了胞內(nèi)總物質(zhì)以及水合離子和蛋白質(zhì)所需的滲透惰性水的總體積。排除體積的理想氣體系統(tǒng)中，滲透壓P和細(xì)胞體積V之間的關(guān)系符合P = NkBT/(V-Vmin)，其中N是細(xì)胞內(nèi)滲透物數(shù)量，kB是玻爾茲曼常數(shù)，T是juedui溫度，Vmin是最小體積。考馬斯亮藍(lán)測量滲透壓縮前后每個(gè)細(xì)胞的總蛋白含量，發(fā)現(xiàn)沒有顯著差異，證實(shí)細(xì)胞體積的減少是水流出所致。

       隨著細(xì)胞體積的減少，胞內(nèi)離子和其他物質(zhì)濃度增加，去除額外的水并進(jìn)一步縮小細(xì)胞越來越困難。水離開細(xì)胞的阻力是滲透體積模量，定義為B = -VdP/dV ~ -VΔP/ΔV。通過改變滲透壓并測量玻璃基底培養(yǎng)的A7細(xì)胞的總體積得到B，發(fā)現(xiàn)它隨細(xì)胞體積的減少而增加（圖1A）。利用P對體積的依賴性，可預(yù)測體積模量即B = NkBTV/(V-Vmin)2。該函數(shù)形式與數(shù)據(jù)匹配jihao（圖1A虛線）。擬合確定的Vmin值為2,053 ± 30 μm3，與jiduan滲透壓下去除所有滲透活性水時(shí)測得的細(xì)胞最小體積（約2,100 μm3）一致。擬合還提供了N值，得到濃度約200 mM，與細(xì)胞內(nèi)已知的鹽濃度一致。表明滲透壓存在情況下，離子和蛋白質(zhì)的總量保持近似恒定。雖然滲透壓平衡很大程度上受離子濃度控制，但隨著游離水離開細(xì)胞，大蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的濃度也會增加。正是這些蛋白質(zhì)和細(xì)胞器（包括細(xì)胞核）的體積決定了Vmin。此外，隨著細(xì)胞接近其最小體積，胞內(nèi)分子擁擠程度必然增加，而這可能導(dǎo)致細(xì)胞行為發(fā)生其他變化。

       諸多細(xì)胞特性中，細(xì)胞皮質(zhì)硬度在滲透壓存在時(shí)受分子擁擠度影響會隨體積變化。使用光學(xué)磁性儀（OMTC）測定A7細(xì)胞的皮質(zhì)剪切模量G，從而確定皮質(zhì)硬度變化（圖S3）。OMTC測得結(jié)果與已有AFM結(jié)果在數(shù)量上一致。隨著外部滲透壓增加，皮質(zhì)剪切模量和體積都快速且同時(shí)變化（圖1B）。去除外部滲透壓后，皮質(zhì)剪切模量立即恢復(fù)至初始值（圖S2B）。細(xì)胞皮質(zhì)硬度與體積模量趨勢相同，可*用相同函數(shù)描述（圖1A）。擬合得到的Vmin值為2,004 ± 41 μm3，與體積模量得到的值非常一致。但剪切模量的值始終比體積模量小三個(gè)數(shù)量級。這種相似性意味著分子擁擠對兩者都有顯著影響。

       細(xì)胞剪切模量的主要源于皮層硬度。但細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈高度異質(zhì)性，內(nèi)部要柔軟得多；細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)是弱彈性凝膠，其剪切模量比皮層的低三個(gè)數(shù)量級。為了測量細(xì)胞質(zhì)的硬度，將PEG包被的聚苯乙烯珠微注射到A7細(xì)胞中，激光鑷子確定胞質(zhì)剪切模量（圖S3）。發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)剪切模量隨細(xì)胞體積減少而增加，遵循與皮質(zhì)剪切模量和體積模量相同的趨勢（圖1A）。隨著細(xì)胞體積進(jìn)一步減小，細(xì)胞質(zhì)剪切模量明顯增加，但值太大無法用激光鑷子測量。在可及的范圍內(nèi)，胞質(zhì)剪切模量與其它兩個(gè)模量函數(shù)形式相同（圖1A底部虛線），但比皮質(zhì)剪切模量的值小三個(gè)數(shù)量級。

圖1 玻璃上生長的A7細(xì)胞的機(jī)械特性與細(xì)胞體積在外部滲透壓下的函數(shù)。（A）滲透體積模量（灰色三角）、皮質(zhì)剪切模量（紅色三角）和胞質(zhì)剪切模量（空心三角）隨細(xì)胞體積減少而增加。穿過灰色三角的虛線表函數(shù)B = NkBTV/(V-Vmin)2 (R2 = 0.99)的最小二乘擬合。穿過皮質(zhì)和胞質(zhì)模量的虛線擬合*相同，分別縮放500和100,000倍。（B）OMTC測量的單個(gè)A7細(xì)胞的皮質(zhì)剪切模量，施加0.26 M PEG 300滲透壓后立即增加，與細(xì)胞體積減少同時(shí)發(fā)生。

02-當(dāng)在較硬的基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞體積減小

       皮質(zhì)硬度是細(xì)胞力學(xué)的一個(gè)關(guān)鍵物理特性，通常隨著細(xì)胞生長基質(zhì)硬度的降低而降低。即使在等滲條件下細(xì)胞形態(tài)也可隨基質(zhì)硬度顯著變化。在涂有Ⅰ型膠原的100μm聚丙烯酰胺（PA）凝膠上培養(yǎng)A7細(xì)胞，通過改變凝膠成分使其剪切模量可在0.1-10 kPa變化，與自然組織的生理彈性相匹配（表S1）。測量細(xì)胞鋪展面積，已知較硬基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞鋪展面積顯著增加（圖2A上，圖2B）。然而結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積并不守恒，隨著基質(zhì)硬度增加，細(xì)胞體積減少。在最堅(jiān)硬基質(zhì)上生長的細(xì)胞的體積較最柔軟基質(zhì)上減少約40%（圖2C）。其他哺乳動物細(xì)胞型，包括HeLa、NIH 3T3、小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（mMSCs）和原代人氣道平滑肌細(xì)胞（HASM）表現(xiàn)出類似的行為（圖2C）。證實(shí)細(xì)胞體積依賴于基質(zhì)硬度具有普遍性。因此，即使外部滲透壓不變，細(xì)胞體積也會改變。

圖2 粘附細(xì)胞的形態(tài)和體積隨基質(zhì)硬度的增加而改變。（A）A7細(xì)胞的俯視圖和側(cè)視圖，分別固定于涂有Ⅰ型膠原的硬（剪切模量10kPa）和軟（剪切模量1200Pa）PA凝膠基質(zhì)上。肌動蛋白皮質(zhì)（綠色），細(xì)胞核（藍(lán)色）。（B）細(xì)胞面積隨基質(zhì)硬度增加而增加。（C）細(xì)胞體積隨基質(zhì)硬度增加而顯著減小。

03-限制細(xì)胞鋪展面積會使細(xì)胞體積增大

       在玻璃基底上培養(yǎng)A7細(xì)胞，微繪制不同大小的膠原“島”以限制細(xì)胞的粘附面積。發(fā)現(xiàn)與鋪展面積不受限制的細(xì)胞相比，鋪展面積受限的細(xì)胞高度更高（圖3A）。此外細(xì)胞體積也隨鋪展面積的減少而增加（圖3B）。在較軟基底上培養(yǎng)時(shí)觀察到同樣效果，即如果細(xì)胞鋪展面積受限小于該基底自由鋪展面積，則細(xì)胞體積增加。不同粘附面積或不同基底硬度都是如此（圖3C藍(lán)色和灰色點(diǎn)）。

04-細(xì)胞體積減少是細(xì)胞內(nèi)水流出所致

       監(jiān)測一個(gè)yidanbaimei化細(xì)胞在硬基質(zhì)上的鋪展情況，以確定等滲條件下細(xì)胞體積減少是由于蛋白質(zhì)含量變化還是由于水的流出。細(xì)胞在約20min內(nèi)從最初的圓形變?yōu)?鋪展開狀態(tài)。在此期間，細(xì)胞體積隨著展開面積增加而減少（圖3D）。不同受限區(qū)域、不同硬度基質(zhì)上，體積和展開面積間的關(guān)系相同（圖3C紅色×）。水可以在一分鐘內(nèi)離開細(xì)胞，而哺乳動物細(xì)胞因生長而產(chǎn)生的胞內(nèi)物質(zhì)數(shù)量變化通常需要幾個(gè)小時(shí)。因此等滲條件下的體積減少zuiyou可能是通過水交換來控制的。

       測量硬基質(zhì)和軟基質(zhì)上培養(yǎng)細(xì)胞每細(xì)胞的總蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)沒有顯著差異。用純PEG置換培養(yǎng)基對細(xì)胞施加jiduan滲透壓，從細(xì)胞中提取所有滲透活性水，發(fā)現(xiàn)所得最小體積Vmin與基質(zhì)硬度無關(guān)（圖4）。由于Vmin可大致反映胞內(nèi)物質(zhì)和滲透不活躍的結(jié)合水的量，因此細(xì)胞體積的變化是由胞內(nèi)游離水的交換引起的。

圖3 A7細(xì)胞體積隨細(xì)胞鋪展面積減少而增加。（A）玻璃上不同大小微島上A7細(xì)胞的3D圖像。（B）隨著玻璃上細(xì)胞鋪展面積增加，細(xì)胞體積減少。（C）不同硬度基質(zhì)上，細(xì)胞體積與投影面積的函數(shù)（灰色圓圈；n > 200）。（D）單個(gè)細(xì)胞在硬基質(zhì)上動態(tài)附著時(shí)細(xì)胞鋪展面積和體積的變化（n = 3）。（E）細(xì)胞體積因水流出而減少的示意圖。

05-細(xì)胞鋪展過程中，離子通道和肌動球蛋白細(xì)胞骨架與細(xì)胞體積減少有關(guān)

       等滲條件下細(xì)胞鋪展時(shí)的水流出與滲透壓存在時(shí)的水流出原因不同。細(xì)胞鋪展過程中，細(xì)胞體積要在等滲條件下減少，為了讓水離開細(xì)胞，滲透物的總量必須改變。由于每個(gè)細(xì)胞的蛋白量保持不變，那么可能是與周圍環(huán)境發(fā)生了離子交換。已知細(xì)胞鋪展過程中細(xì)胞骨架張力增加，而這與離子通道活性增加有關(guān)。因此在細(xì)胞*鋪展后使用0.1mM NPPB抑制氯離子通道。當(dāng)離子通道被阻斷，隨著基質(zhì)硬度增加，細(xì)胞體積的減少受到顯著抑制（圖4B綠色空心三角）。表明等滲條件下細(xì)胞體積的減少需要離子通道活性，通過改變內(nèi)部滲透物的總量來實(shí)現(xiàn)。

       為進(jìn)一步測試活躍的細(xì)胞過程是否會影響細(xì)胞體積變化，用10μM 布雷他汀（blebbistatin）處理細(xì)胞以抑制肌球蛋白II運(yùn)動活性，直接降低細(xì)胞骨架張力。發(fā)現(xiàn)布雷他汀處理阻礙了細(xì)胞在硬基質(zhì)上的體積減少（圖4B藍(lán)色三角）。使用2 mM NaN3和10mM 2-deoxyglucose消耗ATP抑制一般運(yùn)動同樣觀察到類似效果（圖4B粉紅色三角）。進(jìn)一步證明等滲條件下，活躍的細(xì)胞過程與體積減少有關(guān)，細(xì)胞必須使用離子通道主動控制滲透物濃度，以影響水的流出并改變體積。

圖4 藥物處理和滲透壓下的細(xì)胞形態(tài)和體積。（A）對照細(xì)胞和ATP耗竭細(xì)胞在jiduan滲透壓下，硬基質(zhì)和軟基質(zhì)上的三維形態(tài)。細(xì)胞質(zhì)（綠色），細(xì)胞核（黃色）。（B）無主動收縮（布雷他汀處理和ATP耗竭）且處于極度滲透壓下的細(xì)胞，體積與基質(zhì)硬度不呈依賴性；氯離子通道被抑制（NPPB處理）的細(xì)胞，體積對基質(zhì)硬度的依賴性較弱。對照細(xì)胞同圖2C。

06-細(xì)胞模量對細(xì)胞體積有普遍依賴性

       等滲條件下細(xì)胞鋪展面積變大，細(xì)胞皮質(zhì)硬度隨基質(zhì)硬度增加而增加，當(dāng)固定基質(zhì)硬度改變鋪展面積時(shí)，細(xì)胞皮質(zhì)硬度也會增加。當(dāng)基質(zhì)硬度和鋪展面積固定時(shí)，滲透壓增加細(xì)胞硬度也增加，細(xì)胞體積減小。因此，假設(shè)細(xì)胞體積變化是所有這些情況下觀察到的細(xì)胞硬度變化的共同描述因子。將皮質(zhì)硬度繪制為體積的函數(shù)，即在較軟基質(zhì)上生長時(shí)，細(xì)胞硬度隨體積的增加而降低（圖5A）。當(dāng)在固定硬度、不同粘附面積的基質(zhì)上生長時(shí)，細(xì)胞硬度以類似的方式隨體積增加而降低（圖5B）。當(dāng)生長在軟基質(zhì)上并被有外部滲透壓時(shí)（圖5C），以及生長在堅(jiān)硬且鋪展面積高度受限基質(zhì)上有滲透壓時(shí)（圖5D），細(xì)胞硬度增加。將所有數(shù)據(jù)繪制在一張圖表上（圖5E），數(shù)據(jù)出現(xiàn)重疊并且細(xì)胞硬度與細(xì)胞體積之間表現(xiàn)出普遍相關(guān)性。因此細(xì)胞硬度變化可用細(xì)胞體積來描述。本文數(shù)據(jù)都是由單一細(xì)胞類型A7獲得的，其他細(xì)胞類型中盡管振幅和體積上有所偏移，但也觀察到類似的情況（圖S4）。

       拆分?jǐn)?shù)據(jù)，在不施加外部滲透壓情況下，細(xì)胞只對基質(zhì)硬度或鋪展面積的變化做出反應(yīng)，符合G ∝ 1/V2（圖5E實(shí)線）。如果包括所有數(shù)據(jù)，完整行為符合G∝kBTV/(V-Vmin)2（圖5E虛線）。雖然沒有模型預(yù)測剪切模量的行為，但它在函數(shù)形式上與相同體積范圍內(nèi)的體積模量行為相同，即B∝kBTV/(V-Vmin)2，通過測量細(xì)胞P-V關(guān)系得到，反映了當(dāng)水從細(xì)胞中抽出時(shí)分子擁擠程度增加帶來的影響。因此類似的擁擠現(xiàn)象也是皮質(zhì)剪切模量變化的原因。此外多重?cái)_動下滲透體積模量和細(xì)胞質(zhì)剪切模量都普遍依賴于細(xì)胞體積（圖S5），與圖1A所示的滲透壓情況下一樣。

       添加布雷他汀抑制肌動球蛋白收縮的數(shù)據(jù)以探索細(xì)胞硬度和細(xì)胞體積之間相關(guān)性的普遍性，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)硬度與體積還是*相同的函數(shù)曲線（圖5E青色五邊形）。當(dāng)ATP*耗盡時(shí)，數(shù)據(jù)趨勢相同（圖5E黑色三角形）。不僅是分離的細(xì)胞，2D細(xì)胞單層中也觀察到類似行為。將上皮MCF10-A細(xì)胞生長為密度不同的單層，測量相應(yīng)的細(xì)胞體積和皮質(zhì)剪切模量，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積隨細(xì)胞密度的增加而減少（圖S4B）。細(xì)胞體積和硬度依舊存在相關(guān)，即隨著細(xì)胞密度增加，細(xì)胞體積減少，皮質(zhì)硬度增加，符合1/V2。這些結(jié)果意味著細(xì)胞體積參與決定細(xì)胞力學(xué)。

圖5 細(xì)胞皮質(zhì)硬度與細(xì)胞體積的關(guān)系。（A-D）不同條件下，A7細(xì)胞的細(xì)胞皮質(zhì)剪切模量對細(xì)胞體積的依賴性，包括不同硬度基質(zhì)（A），不同大小微圖案的硬基質(zhì)（B），剪切模量100Pa的軟基質(zhì)并施加逐漸增加的滲透壓（C），玻璃基質(zhì)上微圖案限制細(xì)胞鋪展并施加滲透壓（D）。（E）細(xì)胞皮質(zhì)剪切模量與細(xì)胞體積成比例，圖示為細(xì)胞生長在不同硬度基質(zhì)上（灰色圓圈），微圖案限制有效鋪展面積的玻璃基質(zhì)上（藍(lán)色方塊），有滲透壓的軟基質(zhì)上（剪切模量100Pa，綠色倒置三角形），未圖案化有滲透壓玻璃基質(zhì)（紅色三角形），圖案化有滲透壓玻璃基質(zhì)（黃色菱形），10μM布雷他汀處理（青色五邊形）或ATP耗盡（黑色三角形）的玻璃基質(zhì)。實(shí)線表示數(shù)據(jù)的冪律擬合。虛線表示符合G∝kBTV/(V-Vmin)2。

07-細(xì)胞核體積跟隨細(xì)胞體積變化

       核膜像細(xì)胞膜一樣，是選擇性滲透的，允許水交換。因此需要探究細(xì)胞流出的水是否也來自細(xì)胞核。用熒光標(biāo)記細(xì)胞核，3D共聚焦顯微鏡測量核體積。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核體積隨細(xì)胞體積變化，不同基質(zhì)、等滲條件下生長的細(xì)胞如此，體積因外部滲透壓而改變的細(xì)胞也是如此（圖6）。表明隨著細(xì)胞體積的減少，細(xì)胞核也變得更加擁擠，這對細(xì)胞核內(nèi)的運(yùn)動程度有直接影響。測量了GFP標(biāo)記的組蛋白H2B的波動運(yùn)動。計(jì)算均方位移，發(fā)現(xiàn)當(dāng)外部滲透壓使分子擁擠增加時(shí)，波動水平顯著降低（圖6B）。

圖6 細(xì)胞核體積及核動力學(xué)隨細(xì)胞體積的變化。（A）細(xì)胞核體積一般隨細(xì)胞體積變化，減少程度與基質(zhì)硬度、鋪展面積、滲透壓力的增加成比例，測試的各細(xì)胞型中核體積與細(xì)胞體積間的比率近似恒定。（B）MCF-10A細(xì)胞核中GFP標(biāo)記組蛋白的均方圖，反映染色質(zhì)位置波動，0.1 M PEG300jiduan滲透壓情況下顯著減少。

08-細(xì)胞體積改變可調(diào)控干細(xì)胞命運(yùn)

       由于細(xì)胞體積與細(xì)胞硬度以及分子擁擠等其他參數(shù)有內(nèi)在聯(lián)系，因此需要探究細(xì)胞體積對干細(xì)胞分化的影響。通過滲透壓從外部施壓使細(xì)胞體積變化，這會導(dǎo)致細(xì)胞硬度變化，但鋪展面積和基質(zhì)特性沒有變化，也不會改變細(xì)胞內(nèi)的張力（圖S6）。在兩種不同PA凝膠基質(zhì)上生長mMSC，分別為剪切模量7kPa的硬基質(zhì)和剪切模量0.2kPa的軟基質(zhì)。軟基質(zhì)上的細(xì)胞體積通常較大，用0.1 M PEG 300（+100 mOsm）施加額外滲透壓使兩種凝膠上的細(xì)胞體積相匹配（圖7 D和E）。當(dāng)體積匹配時(shí)，細(xì)胞硬度也匹配（圖7F）。將細(xì)胞置于支持成骨和成脂命運(yùn)的雙潛能分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周后，通過堿性磷酸酶（ALP）活性觀察?？梢娕c軟基質(zhì)上未受干擾的細(xì)胞相比，堅(jiān)硬基質(zhì)上成骨分化顯著增加。軟基質(zhì)+滲透壓也表現(xiàn)出ALP活性增強(qiáng)，表明優(yōu)先成骨分化（圖7 A和B）。Western分析成骨生物標(biāo)記物runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）和骨唾液蛋白（BSP）表達(dá)證實(shí)了這一點(diǎn)。

       使用低滲條件（-80 mOsm）使硬基質(zhì)上的細(xì)胞膨脹，使細(xì)胞體積和細(xì)胞核體積與軟基質(zhì)上的細(xì)胞相匹配（圖7 J和K）。當(dāng)體積匹配時(shí)，細(xì)胞硬度也匹配（圖7L）。通過油紅O（ORO）原位染色中性脂質(zhì)堆積，成脂生物標(biāo)志物PPAR-γ表達(dá)（圖7G-I）可觀察到大量成脂分化。表明可以通過改變干細(xì)胞的體積來影響其向成骨或成脂方向的分化，核內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)擁擠會影響干細(xì)胞命運(yùn)。

09-干細(xì)胞命運(yùn)影響細(xì)胞體積

       在缺乏強(qiáng)化學(xué)信號的情況下，基質(zhì)硬度或外部滲透壓等物理特性會影響干細(xì)胞的分化。但化學(xué)信號通常可以超越這些物理信號。在柔軟的PA凝膠上培養(yǎng)mMSCs（偏向成脂分化），向培養(yǎng)基中加入補(bǔ)充劑（β-磷酸甘油、抗壞血酸和Dexamethasone）誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨方向分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)mMSCs進(jìn)行成骨分化，且該過程中細(xì)胞體積減小，甚至成骨分化前就已經(jīng)減小（圖7M）。對硬基質(zhì)上的mMSCs用Dexamethasone單獨(dú)化學(xué)誘導(dǎo)成脂，細(xì)胞體積增加（圖7N）。表明細(xì)胞體積和干細(xì)胞分化密切相關(guān)。

圖7 細(xì)胞體積影響mMSCs分化。（A-F）成骨分化。（A）成骨和成脂組合誘導(dǎo)下mMSC培養(yǎng)1周后，原位染色ALP（黑色）核細(xì)胞（DAPI，藍(lán)色），發(fā)現(xiàn)有滲透壓時(shí)，硬基質(zhì)（剪切模量7kPa）和軟基質(zhì)（剪切模量100Pa）上成骨分化增加。（B）mMSC成骨分化的平均百分比。（C）mMSCs培養(yǎng)3天后Western分析成骨蛋白表達(dá)。（C-F）共聚焦核OMTC測得的細(xì)胞體積（D）、核體積（E）、皮質(zhì)剪切模量（F）。（G-L）成脂分化。（G）組合培養(yǎng)2周后原位染色脂滴（紅色），發(fā)現(xiàn)低滲透壓力下（30% DI水），硬基質(zhì)上成脂分化增加。（H）成脂分化平均百分比。（I）培養(yǎng)1周后Western檢測成脂蛋白表達(dá)（PPAR-γ）。（J-L）共聚焦核OMTC測得的細(xì)胞體積（H）、核體積（K）、皮質(zhì)剪切模量（L）。（M）mMSCs成骨培養(yǎng)培養(yǎng)10天后，F(xiàn)ast Blue染色測量表達(dá)高水平ALP的細(xì)胞的比率。隨著分化細(xì)胞比率增加，細(xì)胞體積相應(yīng)減少。（N）mMSCs成脂培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后，ORO染色測量有明顯脂滴聚集的細(xì)胞比率。隨著分化細(xì)胞比率增加，細(xì)胞體積響應(yīng)增加。

討論

       本研究數(shù)據(jù)確立了細(xì)胞體積和分子擁擠程度在決定細(xì)胞特性（包括細(xì)胞硬度和細(xì)胞內(nèi)動力學(xué)）中的關(guān)鍵重要性。證明了細(xì)胞體積變化可與細(xì)胞內(nèi)含水量變化直接相關(guān)，蛋白和其他物質(zhì)的水平保持不變：當(dāng)?shù)孜镉捕然蚣?xì)胞鋪展面積增加時(shí)，細(xì)胞通過降低其含水量并因此增加其硬度來作出反應(yīng)。雖然肌動球蛋白的收縮性對這種適應(yīng)是bibukeshao的，但細(xì)胞骨架產(chǎn)生的應(yīng)力太弱（約1-10kPa，圖S6），因此細(xì)胞骨架力無法將水分?jǐn)D出細(xì)胞。

       zuiyou可能的是細(xì)胞骨架的收縮張力增加了離子通道的活性，這反過來又影響細(xì)胞間的含水量，從而影響細(xì)胞體積。這與本文發(fā)現(xiàn)一致，即抑制特定離子通道和ATP依賴性過程的活性時(shí)，細(xì)胞體積的變化受到抑制。皮質(zhì)剪切模量和細(xì)胞體積模量的函數(shù)形式與細(xì)胞體積*相同（圖S5）。體積模量行為可以理解為分子擁擠的結(jié)果，但皮質(zhì)剪切模量行為的潛在機(jī)制尚不清楚。

       另外蛋白質(zhì)濃度變化對細(xì)胞生理有重要影響，典型的表現(xiàn)是細(xì)胞體積變化對干細(xì)胞分化的影響。細(xì)胞內(nèi)含水量的變化會改變細(xì)胞內(nèi)分子擁擠度和細(xì)胞動力學(xué)（圖6和圖S7）。這無疑會使許多內(nèi)部生理過程發(fā)生顯著變化，如蛋白質(zhì)折疊和結(jié)合動力學(xué)、結(jié)構(gòu)重排和轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象以及蛋白表達(dá)模式。此外，由于細(xì)胞核的體積隨著細(xì)胞體積的減少而減少，類似的效應(yīng)也會延伸到細(xì)胞核中（圖6A），引發(fā)核內(nèi)分子擁擠度改變，并可能影響層粘連蛋白濃度，從而影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、流動性，影響轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)模式。因此細(xì)胞體積和細(xì)胞核體積可以在生理?xiàng)l件下改變，如組織壓縮和體內(nèi)滲透變化，進(jìn)而影響無數(shù)的細(xì)胞過程，如信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)動力學(xué)，甚至干細(xì)胞分化。

參考文獻(xiàn)：

Guo  M , Pegoraro A F , Mao A , et al. Cell volume change through water  efflux impacts cell stiffness and stem cell fate[J]. Proceedings of the  National Academy of Sciences, 2017, 114(41):201705179.