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       心臟作為人體的重要器官，心肌收縮能力對(duì)其功能至關(guān)重要。心肌細(xì)胞（CMs）的收縮活動(dòng)中斷可能導(dǎo)致各種心臟疾病，同時(shí)，以人工手段改變心肌收縮能力也是治療各類心臟疾病的常用方法。通過人多能干細(xì)胞分化而來的心肌細(xì)胞（hPSC-CMs），由于其易于培養(yǎng)且存活時(shí)間長，十分適合作為心肌細(xì)胞體外生理模型。然而，未經(jīng)處理的hPSC-CMs肌原纖維排列混亂，這限制了它們的收縮能力，即對(duì)成熟CMs的模擬能力。

       今天，與大家分享一篇發(fā)表在PNAS（IF=15.7）上的文章“Contractilityof  single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells  depends onphysiological shape and substrate  stiffness”，作者通過設(shè)置不同生理形態(tài)與基質(zhì)硬度改善了hPSC-CMs的收縮能力，減小與成熟CMs之間的差異，并深入研究了促使hPSC-CMs成熟和影響肌節(jié)功能的內(nèi)在因素。

圖1 不同橫縱比hPSC-CMs的Lifeact標(biāo)記肌動(dòng)蛋白成像

       在10 kPa(心肌細(xì)胞正常基質(zhì)硬度)聚丙烯酰胺水凝膠中培養(yǎng)橫縱比為1:1、3:1、5:1、7:1的矩形hPSC-CMs，并保持其總面積為2000 μm2。經(jīng)Lifeact染色后可清晰的看到肌動(dòng)蛋白(F-actin)在高橫縱比的細(xì)胞中有序排列，且隨著長徑比的增加，排列越規(guī)整，這將有助于提高h(yuǎn)PSC-CMs的收縮性及機(jī)械功率。

圖2 牽引力顯微鏡計(jì)算zuida牽引力空間分布圖3:1、5:1、7:1、普通hPSC-CMs和1:1 hPSC-CMs (左)，不同橫縱比hPSC-CMs Σ|Fc|的變化圖(右)

       牽引力顯微鏡計(jì)算所得的基質(zhì)牽引力數(shù)據(jù)顯示橫縱比為7:1的細(xì)胞收縮力(Σ|Fc|)zuiqiang，且平均收縮速度與其他hPSC-CMs保持一致，即可知此時(shí)hPSC-CMs的機(jī)械功率的差異主要體現(xiàn)在收縮力上，二者成正比。隨著橫縱比增大，hPSC-CMs收縮的zuida速度有所增加，表明定形處理有助于提高機(jī)械功率與收縮性。在2000  μm2的未定型hPSC-CMs中，其收縮力與1:1的hPSC-CMs相似，而肌原纖維的不規(guī)則分布則使其收縮力仍然小于3:1的hPSC-CMs。

圖3  Lifeact標(biāo)記肌原纖維線掃描成像(左)，每μm肌節(jié)的平均收縮力(中)，肌原纖維軸向運(yùn)動(dòng)比例(右)

       此外，經(jīng)過對(duì)細(xì)胞收縮與舒張長度的測量，橫縱比與肌節(jié)收縮的程度成正相關(guān)。通過粒子示蹤測速法追蹤F-actin，量化hPSC-CMs在主軸X與副軸Y上的運(yùn)動(dòng)情況[u(x)/v(y)]。結(jié)果顯示，高橫縱比的細(xì)胞在主軸方向收縮能力zuiqiang，這歸因于肌原纖維的大范圍有序排列使得肌節(jié)縮短，zuida限度地增加了hPSC-CMs的機(jī)械輸出。軸向高度有序的肌原纖維排列也是CMs成熟的一個(gè)標(biāo)志，此時(shí)hPSC-CMs可更好的對(duì)CMs進(jìn)行模擬。

圖4 不同細(xì)胞形態(tài)與基質(zhì)硬度下收縮力對(duì)比(左)，6 kPa下hPSC-CMs 肌原纖維彎曲(中)，35 kPa下肌原纖維部分?jǐn)嗔?右)

       之后，作者又制備了模擬胚胎心肌(6 kPa)和纖維化心肌(35 kPa)的水凝膠用以研究不同硬度基質(zhì)下hPSC-CMs的收縮情況。如圖所示，35   kPa下細(xì)胞的收縮力zuidi僅為前二者的10%。一般情況下，細(xì)胞膜張力隨橫縱比的增加而增大，而胞內(nèi)張力隨基質(zhì)硬度增加而增加。此時(shí)由于高基質(zhì)硬度造成了胞內(nèi)張力超過閾值，大量肌原纖維發(fā)生斷裂(25%)，相似的，在6   kPa下，低張力可使肌原纖維產(chǎn)生松弛與彎曲。為了證明張力閾值的存在，通過手動(dòng)拉伸水凝膠提升細(xì)胞膜張力，在拉伸5-10%時(shí)細(xì)胞力增強(qiáng)約10%，達(dá)到14%時(shí)肌原纖維開始斷裂，之后細(xì)胞停止收縮或收縮力急劇下降。同時(shí)，在35  kPa下培養(yǎng)的hPSC-CMs隨著胞外鈣離子(刺激細(xì)胞收縮)濃度的增加，肌原纖維斷裂率明顯上升，表明高硬度抑制了細(xì)胞收縮性，否則將會(huì)有更多肌原纖維斷裂(＞50%)。

圖5 EDTA、諾考達(dá)唑、ML-7和BDM處理后hPSC-CMs的變化情況(A)，對(duì)應(yīng)處理后細(xì)胞長度變化(B)，肌聯(lián)蛋白(titin N2A, N2B)與肌鈣蛋白(TnI, 替恩替)在不同條件下(patterned, glass, 10kPa, 35kPa)的表達(dá)情況(下側(cè))

       為了研究胞內(nèi)張力對(duì)肌原纖維的有序排列是否有影響，使用EDTA培養(yǎng)hPSC-CMs以消除其胞內(nèi)張力，發(fā)現(xiàn)肌原纖維的松弛和肌節(jié)周期性組織會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸松弛和消失。之后，利用諾考達(dá)唑或細(xì)胞松弛素D(抑制肌球蛋白)抑制細(xì)胞骨架聚合，或通過其他小分子再次消除胞內(nèi)張力(ATP酶抑制劑抑制非肌肉肌球蛋白II型與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合，ML-7抑制非肌肉肌球蛋白輕鏈激酶，或BDM抑制非肌肉肌球蛋白的ATM酶)。結(jié)果顯示只有諾考達(dá)唑處理后的hPSC-CMs內(nèi)部肌原纖維重新有序排列，表明肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白在肌原纖維的有序排列中起到了重要的作用。而后，又測定了肌聯(lián)蛋白(titin N2A, N2B)與肌鈣蛋白(TnI, )在不同條件下(是否經(jīng)過塑形、基底的種類與硬度)的表達(dá)情況，結(jié)果表明基質(zhì)硬度和細(xì)胞形態(tài)可通過調(diào)節(jié)肌節(jié)張力的機(jī)制協(xié)同調(diào)節(jié)hPSC-CMs的收縮性。

圖6 7:1和未塑形hPSC-CMs的鈣離子瞬變圖及線粒體分布圖(上側(cè))，電生理測試，定量(q)RT-PCR 測試及暗場橫斷管成像(下側(cè))

       另外，隨著肌節(jié)活性的提高，hPSC-CMs的成熟度也進(jìn)一步的改善。鈣瞬變、線粒體的分布、電生理學(xué)特性和橫斷管的形成等都可以顯示hPSC-CMs的成熟情況。如圖所示，在7:1的hPSC-CMs中，鈣離子隨著細(xì)胞的收縮而產(chǎn)生軸向移動(dòng)，而線粒體主要分布于細(xì)胞核周圍及細(xì)胞兩端，在電生理測試中，膜片鉗記錄處理后的hPSC-CMs具有更低的靜息膜電位、更高的動(dòng)作電位振幅和更高的zuida上升速率，同時(shí)，還可以在hPSC-CMs表面找到沿細(xì)胞膜分布的橫斷管結(jié)構(gòu)，這些特征都表明hPSC-CMs與正常的人心肌細(xì)胞十分相近。再次體現(xiàn)了其作為體外生理模型的優(yōu)勢。不過，對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行的定量(q)RT-PCR結(jié)果表明，在基因表達(dá)的層面，是否經(jīng)過pattern處理的hPSC-CMs并未產(chǎn)生明顯的區(qū)別。

總結(jié)

       本研究表明，在hPSC-CMs中，可以通過調(diào)節(jié)生理形態(tài)和基質(zhì)硬度來影響細(xì)胞張力(調(diào)節(jié)收縮力，建立和維持肌原纖維排列)，使得肌節(jié)縮短并轉(zhuǎn)化為更高的機(jī)械輸出。橫縱比為7:1的hPSC-CMs的肌節(jié)活性zuigao且肌原纖維排列zuiwei規(guī)整，而收縮能力的增強(qiáng)也表明其更加接近成熟的CMs。同時(shí)，經(jīng)處理后的hPSC-CMs在電生理特性、鈣瞬變、線粒體分布和橫斷管結(jié)構(gòu)的存在與成熟的CMs更為相似。這進(jìn)一步提升了patterned-hPSC-CMs在體外心臟健康和疾病模型研究中的潛力。

參考文獻(xiàn):

Ribeiro  A J S , Ang Y S , Fu J D , et al. Contractility of single  cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on  physiological shape and substrate stiffness[J]. Proceedings of the  National Academy of ences of the United States of America, 2015,  112(41).