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研究亮點：

1 系統(tǒng)性方法揭示了GATA4在人類心臟發(fā)育和功能中的作用
2 雜合子GATA4錯義突變損害心臟基因程序
3 GATA4 G296S突變破壞了心臟增強(qiáng)子TBX5的基因組占用
4 PI3K信號通路是GATA4基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵樞紐

研究背景

轉(zhuǎn)錄因子(TFs)之間的組合相互作用導(dǎo)致組織特異性基因表達(dá)，從而決定了細(xì)胞的特性并維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平。TFs通過招募其他TFs、輔激活因子或輔抑制因子來激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄。超級增強(qiáng)子(SEs)，被中介復(fù)合物和TFs密集占據(jù)的假定增強(qiáng)子簇，被認(rèn)為是發(fā)育和疾病中細(xì)胞同一性的調(diào)節(jié)因子。SEs的失調(diào)可能導(dǎo)致人類胚胎發(fā)生發(fā)育障礙和產(chǎn)后疾病。發(fā)育畸形占人類出生率大于5%。其中，先天性心臟缺損所占比例maximum（0.8%），而且通常是由于發(fā)育性調(diào)節(jié)型心臟TFs單倍型不足而導(dǎo)致的。在TFs中雜合突變GATA4和TBX5會導(dǎo)致家族性先天性心臟發(fā)育不全，二者表型重疊；當(dāng)過表達(dá)這兩個基因時，兩者免疫共定位。在零星的先天性心臟發(fā)育不全中，這兩個基因存在突變，且與心肌病相關(guān)。我們之前的研究表明，GATA4在G296S位點的突變會導(dǎo)致GATA4和TBX5在體外的互作能力受損。攜帶復(fù)合雜合子Gata4和Tbx5突變的小鼠會發(fā)生房室間隔缺損，為GATA4與TBX5二者之間的互作提供了遺傳學(xué)證據(jù)。

盡管Gata4和Tbx5對小鼠心臟發(fā)生至關(guān)重要，但它們在人類心肌細(xì)胞（CMs）中共同調(diào)節(jié)的基因靶點或信號通路以及它們?nèi)绾握{(diào)節(jié)人類心臟間隔的形成尚不清楚。與GATA4相互作用的TBX5或Nkx2.5*缺失，表明這些TFs在小鼠心臟分化中相互依賴調(diào)節(jié)彼此的基因組占用。

研究結(jié)果

轉(zhuǎn)錄因子中高度保守殘基的突變可能會影響蛋白與蛋白或蛋白間的相互作用，導(dǎo)致基因網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)和人類疾病。本研究使用患者源性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)細(xì)胞來剖析GATA4在人類心臟發(fā)育和功能中的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究人員利用了來自于患者G296S突變的、通過CRISPR-Cas9修正的(iWT)   以及正常人的野生型（WT）成纖維細(xì)胞以非整合游離載體方法重編程獲得三種iPS，在圖案化水凝膠的作用下將iPS培養(yǎng)分化為心肌細(xì)胞CMs。在分化CMs過程中，對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及分析，對心肌細(xì)胞分化過程中的標(biāo)志性基因表達(dá)情況，鈣通量及顯微鏡下形態(tài)進(jìn)行了檢測和分析。

研究發(fā)現(xiàn)，雜合的GATA4  G296S突變損害了心臟基因程序和sonic hedgehog  (SHH)信號通路的表達(dá)，同時上調(diào)了可變命運基因的表達(dá)，特別是內(nèi)皮細(xì)胞譜系和與心臟分隔相關(guān)的基因。在與心臟發(fā)育和肌肉收縮相關(guān)的基因SE元件處，GATA4依賴的TBX5的募集被中斷，而在參與內(nèi)皮分化的基因座染色質(zhì)關(guān)閉失敗。這項工作揭示了一個關(guān)鍵心臟TF的單一錯義突變是如何通過劑量依賴性調(diào)節(jié)TF復(fù)合物向增強(qiáng)因子的招募而導(dǎo)致疾病的，并揭示了治療干預(yù)的潛在節(jié)點。

圖1 G296S CMs心臟功能受損。（A）流式分析來源于WT和G296S分化而來的、乳酸純化后的c替恩替+CMs   。（B）CMs的單細(xì)胞陣列的微圖(上)和α-Actinin或F-actin的免疫染色(下)。（C）微觀模式的收縮測量。WT和G296S單厘米對1  Hz起搏響應(yīng)的百分比（左圖）。牽引力顯微鏡測量力產(chǎn)生作為細(xì)胞運動的CMs對1Hz起搏響應(yīng)的函數(shù)(右圖)。（D） WT和G296S  CMs的動作電位測量。（E）微團(tuán)簇上鈣通量的測量。（F）特定微組織的鈣通量測量。（G）α-Actinin染色觀察單個肉瘤類CMs所占的百分比。（H）線粒體單厘米微模式染色強(qiáng)度(上圖)。定量測量細(xì)胞核分裂追蹤器相對于細(xì)胞面積的紅色強(qiáng)度(下圖)。（I）糖酵解功能測量。

圖2 GATA4 - TBX5 GRN顯示樞紐集中于PI3K信號。（A）GATA4控制的GRN（B）按基因符號命名的前20個樞紐的子網(wǎng)絡(luò)圖（C）在PI3K信號被抑制(圓形)或激活(三角形)后iWT(黑色)和G296S(紅色)CMs產(chǎn)生的相對變化（D）PI3K信號被抑制(圓形)或激活(三角形)后，iWT(黑色)和G296S(紅色)CMs的搏動率測量（E）假設(shè)模型。上圖，WT基因的心臟基因位點開放且允許G4T5與med1結(jié)合的SE元件結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄;G4T5和HDAC2抑制異常內(nèi)皮基因轉(zhuǎn)錄。下圖，GATA4   G296S的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳結(jié)果。心臟基因座降低了開放染色質(zhì)和TBX5與SE元素的結(jié)合，降低了轉(zhuǎn)錄;異常開放的染色質(zhì)缺失了GATA4-HDAC2，但TBX5富集，同時ETS因子的基序?qū)е聝?nèi)皮基因轉(zhuǎn)錄沉默失敗，其他參與間隔發(fā)育的位點未描述。

研究意義

本研究表明，適當(dāng)?shù)男呐K發(fā)育和功能需要MED1結(jié)合的h3k27ac標(biāo)記SE元素的GATA4-TBX5的共同參與，以維持開放的染色質(zhì)狀態(tài)并激活心源性基因轉(zhuǎn)錄。雜合性GATA4錯義突變影響蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，TBX5無法募集到SE元件與未能保持開放的染色質(zhì)狀態(tài)以及心臟基因的轉(zhuǎn)錄降低有關(guān)。GATA4   G296S突變允許TBX5和其他轉(zhuǎn)錄激活因子的錯誤定位，導(dǎo)致無法招募到HDAC2，并在內(nèi)皮啟動子上實現(xiàn)更封閉的染色質(zhì)特征。結(jié)果導(dǎo)致內(nèi)皮基因表達(dá)的異常激活和譜系改變。參與SHH信號接收和心臟分離的基因失調(diào)為GATA4   G296S患者的三維間隔缺損提供了分子基礎(chǔ)。這些研究揭示了TF復(fù)合物如何通過協(xié)同調(diào)控反式作用因子的全基因組定位來控制基因表達(dá)的激活和抑制，以及當(dāng)協(xié)同性被破壞時疾病是如何發(fā)生的。

這一研究結(jié)果解釋了一個啟動人類心臟基因程序的組合TF結(jié)合密碼子，并揭示了通過錯義突變破壞該密碼子如何導(dǎo)致表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄失調(diào)和人類疾病。ATAC-seq分析開放染色質(zhì)特征和GATA4和TBX5結(jié)合位點的全基因組分析提供了人類TF結(jié)合增強(qiáng)子的詳細(xì)目錄，并補(bǔ)充了稀缺心臟細(xì)胞類型的編碼數(shù)據(jù)，同時利用這些數(shù)據(jù)鑒定了一個假定的G4T5輔抑制子。綜上所述，本研究揭示了一個組合的TF代碼，這一代碼確保了一個強(qiáng)大的心臟基因程序，闡明了當(dāng)通過干擾該代碼的TF協(xié)同性時人類疾病是如何發(fā)生的，并提出了治療干預(yù)的潛在節(jié)點。

本實驗中特別涉及了一種細(xì)胞培養(yǎng)和測量手段

iPS-CMs細(xì)胞的體外培養(yǎng)
將細(xì)胞接種在聚丙烯酰胺水凝膠裝置上，該裝置具有基質(zhì)凝膠微結(jié)構(gòu)。由縮印手段在水凝膠表面制備長寬比為7:1、面積為2000平方微米的矩形凹槽。這些特定的微結(jié)構(gòu)具備一定的剛度及形狀，有利于模擬體內(nèi)CMs的真實環(huán)境，可原位培養(yǎng)并分析單個CMs。之后，可用牽引力顯微鏡計算細(xì)胞附著在聚丙烯酰胺表面所產(chǎn)生的力。

單個CMs收縮力測量
在水凝膠中混入熒光微珠，使用Zeiss倒置顯微鏡測試收縮CMs的明場視頻以及因細(xì)胞收縮而移動的綠色熒光微珠的視頻。明場視頻被用來計算每個收縮周期的細(xì)胞運動及平均位移。熒光微珠視頻則提交到牽引力顯微鏡算法來計算收縮力。

鈣通量分析，膜片鉗測試
Fluo-4染色后采用延時成像技術(shù)來測量鈣通量。選擇自發(fā)收縮的微團(tuán)簇的特定區(qū)域，用軟件量化動作電位之間測量到的鈣瞬變表達(dá)相對于基線熒光的峰值振幅。采用全細(xì)胞膜片鉗在單細(xì)胞水平測量CMs的動作電位

作為實驗前置內(nèi)容，細(xì)胞培養(yǎng)與力學(xué)、鈣通量測試在后續(xù)基因表達(dá)分析工作中起到了關(guān)鍵性的作用。在該工作中使用的是英國Plexithermo的HCells高通量單細(xì)胞、器官功能測量及納米水凝膠3D培養(yǎng)系統(tǒng)。

該系統(tǒng)可使用多種定制水凝膠耗材模擬細(xì)胞微環(huán)境，亦可以自行設(shè)計蝕刻水凝膠以滿足不同的研究需求，尤其適用于心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境的構(gòu)建。搭配unique的細(xì)胞追蹤技術(shù)，可短時間內(nèi)測量300個以上細(xì)胞的收縮及離子濃度變化情況。搭配多孔位細(xì)胞培養(yǎng)板，實現(xiàn)真正的高通量細(xì)胞測試，每個孔位即可作為一組對照實驗，不同孔位同時培養(yǎng)，同時測量，極大節(jié)省時間及耗材。

適用范圍：

1、心肌細(xì)胞
采用超速成像納米水凝膠技術(shù)，可wanmei模擬器官硬度。批量測心肌細(xì)胞的力學(xué)指標(biāo)和離子濃度變化。包括細(xì)胞收縮速度和力度、收縮功率，收縮角度，速度差和力差等，

2、細(xì)胞遷移和精子運動軌跡
跟蹤檢測細(xì)胞軌跡，并可計算定量數(shù)據(jù)，如：運動軌跡，距離和速度。

3、動態(tài)跟蹤細(xì)胞增殖的情況，如菌落形成。

4、人iPS細(xì)胞衍生神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞活力測定：神經(jīng)元運動的功率譜密度（PSD）可，用于準(zhǔn)確預(yù)測細(xì)胞死亡。PSD表示一個單元在頻域中的運動強(qiáng)度，能夠更精確地預(yù)測細(xì)胞死亡。

5、核跟蹤特征可用于分析癌細(xì)胞遷移

6、測量對象：癌細(xì)胞、斑馬魚、精子、菌落、貼壁細(xì)胞（如：急性分離的成年小鼠細(xì)胞，乳鼠細(xì)胞、成年大鼠的心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等）。

參考文獻(xiàn)：

Ang  Y S , Rivas R N , Ribeiro A J S , et al. Disease Model of GATA4  Mutation Reveals Transcription Factor Cooperativity in Human  Cardiogenesis[J]. Cell, 2016, 167(7):1734-1749.e22.