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反相色譜柱的注意事項(xiàng)和維護(hù)保養(yǎng)

  色譜柱的正確使用方法和細(xì)致的維護(hù)工作很重要，使用和維護(hù)不當(dāng)會降低柱效、縮短壽命甚至損壞。在反相色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱的高效性和******性。

一、避免壓力和溫度的急劇變化

溫度突變或使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓突然升高或降低也會沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩。

二、★勿直接改變?nèi)軇┙M成

改變?nèi)軇┑慕M成時(shí)，應(yīng)逐漸緩慢改變，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?/p>

三、★禁止反沖

一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。

四、流動(dòng)相方面

★1.流動(dòng)相須經(jīng)過超聲和0.45um濾膜除去微粒；

★2.純度要求?

→超純水（HPLC用水）；

→緩沖液pH值2~8；

→緩沖鹽濃度（一般10mM~20mM）；

→有機(jī)溶劑（色譜純，雜質(zhì)含量盡量低）。

★提示：選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），可避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，可使流動(dòng)相在進(jìn)固定相之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

五、樣品方面

1.確保樣品不和填料基質(zhì)相互作用；

2.了解樣品的溶解性，若樣品的溶劑不是流動(dòng)相，用流動(dòng)相試溶解，防止樣品析出；

3.樣品上樣前須經(jīng)過0.45um的濾膜過濾去除微粒和雜質(zhì)；

4.避免將復(fù)雜的樣品尤其生物樣品直接注入柱內(nèi)，在進(jìn)樣器和色譜柱間連一保護(hù)柱。

六、保清潔防干燥

保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。

七、加補(bǔ)填料

反相色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。新的色譜柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。

八、清洗

★水/乙腈（95/5）→****乙腈→乙腈/異丙醇（75/25）→****異丙醇→****二氯甲烷→****己烷

九、再生

★30倍柱體積?正己烷→二氯甲烷→異丙醇→二氯甲烷→流動(dòng)相。

★注意：若需用到二氯甲烷、己烷，使用反相流動(dòng)相前需用異丙醇過渡?。

★柱子使用完后，用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。

十、保存??

1.存放前的處理（除去雜質(zhì)、緩沖鹽）；?

2.合適的存放溶劑（甲醇抑菌能力強(qiáng)于乙腈）；?

3.避免柱床的干涸；

4.避免機(jī)械震動(dòng)（輕拿輕放）；?

5.存放的溫度4~30℃。?

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