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細(xì)節(jié)決定成敗，western blot更是如此，那讓我一一為大家介紹這些細(xì)節(jié)的地方吧。 

一、 樣品準(zhǔn)備部分

有好的開始，才會有好的結(jié)果。良好的樣品的制備，是WB的重中之重，特別是以下幾個(gè)方面：

1. 時(shí)間把控到位

盡管樣品的處理濃度可能不同，處理時(shí)間也可能不同，無論是孵育的時(shí)間還是終止的時(shí)間，都要按照預(yù)先設(shè)計(jì)的時(shí)間來進(jìn)行，提前或者推遲，都會影響最終的結(jié)果。

2. 防止蛋白降解

防止蛋白降解的方法通常有兩種：

（1）低溫操作

所有的用具、樣品、裂解液等都提前預(yù)冷，實(shí)驗(yàn)全程在低溫（4℃）下操作，可以有效防止蛋白講解

（2）蛋白酶抑制劑

將蛋白酶抑制劑和PMSF共同使用，能有效防止蛋白降解。

3. 裂解液用量把控精確

裂解液的用量直接決定了細(xì)胞裂解程度以及裂解后的蛋白濃度。若裂解液量較少，就會導(dǎo)致蛋白濃度太高，與上樣緩沖液反應(yīng)不充分，電泳后會出現(xiàn)多條條帶，條帶形狀也不好；若裂解液量過多，蛋白濃度被稀釋，會導(dǎo)致在膠孔中的上樣量不足，條帶不清晰。

二、 WB 電泳部分

有了好的開端，再加上好的過程，勢必會有好的結(jié)果。WB過程中需要注意的細(xì)節(jié)如下：

1. 制膠

Biorad的制膠試劑盒，讓制膠的日子灑滿了陽光。

2. 上樣

實(shí)驗(yàn)不同，上樣的總蛋白量稍有不同。若上樣體積小的，可用槍頭直接上樣；若上樣體積>20ul，建議采用微量注射器；若上樣體積太大，可采取間斷上樣。

3. 電泳

樣品到達(dá)分離膠之前，控制電壓≤60V，能有效解決樣品排列不整齊的問題。樣品到達(dá)分離膠之后，可調(diào)節(jié)電壓為100V，若時(shí)間充足，維持電壓在60V以下，效果更好。

4. 轉(zhuǎn)膜

電泳開始后就配置電轉(zhuǎn)液，加入甲醇，預(yù)冷。預(yù)冷是神助。

我們的實(shí)驗(yàn)，有了上述的神助攻的細(xì)節(jié)，期待你的結(jié)果吧。