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中國農(nóng)業(yè)研發(fā)出4套使用LUYOR-3415和基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測工具

CRISPR/Cas基因編輯定點突變、修飾、表達(dá)調(diào)控，已被廣泛應(yīng)用于動物、植物與微生物基礎(chǔ)研究與遺傳改良。靶向DNA的CRISPR/Cas12和靶向RNA的CRISPR/Cas13被開發(fā)成靈敏、的核酸檢測工具，以應(yīng)用于包括病毒等多種RNA、DNA病毒與其它核酸等診斷或檢測。已有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cas12/crRNA（CRISPR-RNA）或Cas13/crRNA復(fù)合體結(jié)合到靶標(biāo)核酸底物后，既可啟動靶向的順式剪切，還能夠引發(fā)對其旁側(cè)的ssDNA或ssRNA的非特異性“反式切割”活性，如果在體系內(nèi)加入由熒光基團(tuán)/猝滅基團(tuán)或抗體/標(biāo)記組成的核酸報告分子，從而釋放熒光或標(biāo)記信號，實現(xiàn)對核酸的定性或定量診斷或檢測。對靶標(biāo)核酸進(jìn)行偶聯(lián)等溫擴增處理，該系統(tǒng)的檢測靈敏度可達(dá)到單分子水平。目前，已挖掘出從生黃瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens XPD3002）CRISPR效應(yīng)酶Cas13d正向同源蛋白，即RfxCas13d。經(jīng)鑒定，RfxCas13d在哺乳動物與植物中有很高的靶向RNA基因編輯活性，且該酶體積與分子量比其它酶小30%，具備基因編輯及其衍生工具開發(fā)優(yōu)勢。然而，該酶作為核酸檢測工具酶的具體參數(shù)特征，例如其特異性水平仍沒有系統(tǒng)的數(shù)據(jù)報道。

近日，中國農(nóng)業(yè)作物科學(xué)研究所研究團(tuán)隊在鑒定RfxCas13d靶向RNA引發(fā)“反式切割”活性基本特征的基礎(chǔ)上，研發(fā)出基于CRISPR/RfxCas13d檢測工具，詳細(xì)比較了RfxCas13d、LwaCas13a、LbCas12a與AsCas12a活性，建立了多套核酸檢測工具，并研發(fā)出田間實時可視化靈敏定性定量檢測方法。該研究拓展了基于CRISPR原理核酸檢測工具的技術(shù)能力與應(yīng)用范圍，具有重要的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價值。相關(guān)研究結(jié)果以“A Field-Deployable Method for Single and Multiplex Detection of DNA or RNA from Pathogens Using Cas12 and Cas13”為題在SCIENCE CHINA Life Sciences 雜志在線發(fā)表。

該研究在重組表達(dá)與純化4種CRISPR效應(yīng)蛋白基礎(chǔ)上，首先鑒定了crRNA/RfxCas13d靶向靶標(biāo)引發(fā)的單鏈寡聚核酸熒光報告分子的堿基偏好性，結(jié)果表明RfxCas13d蛋白偏好于切割多聚核苷酸連接的報告分子（PolyrU），而PolyrA、PolyrC與PolyrG切割活性極低，該特征與LwaCas13a類似，但與AsCas12a、LbCas12a傾向于PolyA/T/C明顯不同，為Cas13與Cas12蛋白之間開發(fā)復(fù)合檢測工具奠定了可區(qū)分性報告分子；分別在向?qū)rRNA分子或靶標(biāo)RNA上設(shè)置系列位置的單、雙堿基錯配，鑒定其引發(fā)切割活性，結(jié)果表明該系統(tǒng)特異性達(dá)到了可識別單堿基差異水平；為了研究不同體系之間的兼容性，鑒定了6種緩沖溶液體系，鑒定的多酶高活性體系進(jìn)一步為復(fù)合檢測方法奠定了反應(yīng)體系基礎(chǔ)；為了增強檢測的靈敏性，詳細(xì)鑒定了靶向底物等溫擴增體系及其反應(yīng)動力學(xué)，結(jié)果表明偶聯(lián)等溫擴增后檢測靈敏度可達(dá)到aM量級，反應(yīng)體系僅有數(shù)個拷貝的靶標(biāo)分子即可引發(fā)明顯的檢測信號。該研究建立了基于RfxCas13d、AsCas12a、LbCas12a與LwaCas13a等4種工具酶高特異性、靈敏性、兼容性的核酸分子檢測方法。

為驗證該系列技術(shù)實際應(yīng)用，選擇了主要農(nóng)作物生產(chǎn)上的重大病害病原體為檢測對象進(jìn)行了多方面評估。DNA檢測驗證試驗選擇了真菌性病害禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）和擬輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides），這兩種致病性真菌是小麥“癌癥”--赤霉病的主要病原體，也是玉米穗粒腐和莖腐病罪魁禍?zhǔn)祝粌H嚴(yán)重影響產(chǎn)量，還產(chǎn)生毒素影響谷物品質(zhì)。RNA檢測驗證選擇了水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus ，RBSDV），該RNA病毒可通過灰飛虱（Laodelphax striatellus）在水稻、小麥和玉米宿主之間遷移傳播，分別導(dǎo)致水稻黑條矮縮病、小麥矮縮病和玉米粗縮病，威脅糧食作物生產(chǎn)。研究結(jié)果表明4個核酸檢測系統(tǒng)對包含這些病原體DNA或RNA的田間實際樣本粗提物檢測靈敏，且可利用LUYOR-3415小型手持式熒光儀或Strip試紙條田間現(xiàn)場定性讀取結(jié)果，也可以在實驗室開展定量分析。此外，以禾谷鐮孢與擬輪枝鐮孢菌復(fù)合侵染為樣本，建立了基于Cas12/Cas13聯(lián)合應(yīng)用的復(fù)合檢測，實現(xiàn)一個檢測多種病原診斷判讀，進(jìn)一步拓展了檢測工具的應(yīng)用場景與潛力。由于快速基于病原體基因組信息找到特征性的靶標(biāo)核酸序列，該工具為當(dāng)前仍無有效診斷技術(shù)的病原體檢測提供了、低成本的開發(fā)途徑。此外，該系列檢測方法還可應(yīng)用于食品安全質(zhì)量檢驗、動植物檢疫、轉(zhuǎn)基因檢測、動植物群體的基因分型與基因表達(dá)檢測，具有重要的應(yīng)用價值。