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中國農業(yè)研發(fā)出4套使用LUYOR-3415和基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測工具

CRISPR/Cas基因編輯定點突變、修飾、表達調控，已被廣泛應用于動物、植物與微生物基礎研究與遺傳改良。靶向DNA的CRISPR/Cas12和靶向RNA的CRISPR/Cas13被開發(fā)成靈敏、的核酸檢測工具，以應用于包括病毒等多種RNA、DNA病毒與其它核酸等診斷或檢測。已有研究發(fā)現(xiàn)，當Cas12/crRNA（CRISPR-RNA）或Cas13/crRNA復合體結合到靶標核酸底物后，既可啟動靶向的順式剪切，還能夠引發(fā)對其旁側的ssDNA或ssRNA的非特異性“反式切割”活性，如果在體系內加入由熒光基團/猝滅基團或抗體/標記組成的核酸報告分子，從而釋放熒光或標記信號，實現(xiàn)對核酸的定性或定量診斷或檢測。對靶標核酸進行偶聯(lián)等溫擴增處理，該系統(tǒng)的檢測靈敏度可達到單分子水平。目前，已挖掘出從生黃瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens XPD3002）CRISPR效應酶Cas13d正向同源蛋白，即RfxCas13d。經鑒定，RfxCas13d在哺乳動物與植物中有很高的靶向RNA基因編輯活性，且該酶體積與分子量比其它酶小30%，具備基因編輯及其衍生工具開發(fā)優(yōu)勢。然而，該酶作為核酸檢測工具酶的具體參數(shù)特征，例如其特異性水平仍沒有系統(tǒng)的數(shù)據(jù)報道。

近日，中國農業(yè)作物科學研究所研究團隊在鑒定RfxCas13d靶向RNA引發(fā)“反式切割”活性基本特征的基礎上，研發(fā)出基于CRISPR/RfxCas13d檢測工具，詳細比較了RfxCas13d、LwaCas13a、LbCas12a與AsCas12a活性，建立了多套核酸檢測工具，并研發(fā)出田間實時可視化靈敏定性定量檢測方法。該研究拓展了基于CRISPR原理核酸檢測工具的技術能力與應用范圍，具有重要的產業(yè)應用價值。相關研究結果以“A Field-Deployable Method for Single and Multiplex Detection of DNA or RNA from Pathogens Using Cas12 and Cas13”為題在SCIENCE CHINA Life Sciences 雜志在線發(fā)表。

該研究在重組表達與純化4種CRISPR效應蛋白基礎上，首先鑒定了crRNA/RfxCas13d靶向靶標引發(fā)的單鏈寡聚核酸熒光報告分子的堿基偏好性，結果表明RfxCas13d蛋白偏好于切割多聚核苷酸連接的報告分子（PolyrU），而PolyrA、PolyrC與PolyrG切割活性極低，該特征與LwaCas13a類似，但與AsCas12a、LbCas12a傾向于PolyA/T/C明顯不同，為Cas13與Cas12蛋白之間開發(fā)復合檢測工具奠定了可區(qū)分性報告分子；分別在向導crRNA分子或靶標RNA上設置系列位置的單、雙堿基錯配，鑒定其引發(fā)切割活性，結果表明該系統(tǒng)特異性達到了可識別單堿基差異水平；為了研究不同體系之間的兼容性，鑒定了6種緩沖溶液體系，鑒定的多酶高活性體系進一步為復合檢測方法奠定了反應體系基礎；為了增強檢測的靈敏性，詳細鑒定了靶向底物等溫擴增體系及其反應動力學，結果表明偶聯(lián)等溫擴增后檢測靈敏度可達到aM量級，反應體系僅有數(shù)個拷貝的靶標分子即可引發(fā)明顯的檢測信號。該研究建立了基于RfxCas13d、AsCas12a、LbCas12a與LwaCas13a等4種工具酶高特異性、靈敏性、兼容性的核酸分子檢測方法。

為驗證該系列技術實際應用，選擇了主要農作物生產上的重大病害病原體為檢測對象進行了多方面評估。DNA檢測驗證試驗選擇了真菌性病害禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）和擬輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides），這兩種致病性真菌是小麥“癌癥”--赤霉病的主要病原體，也是玉米穗粒腐和莖腐病罪魁禍首，不僅嚴重影響產量，還產生毒素影響谷物品質。RNA檢測驗證選擇了水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus ，RBSDV），該RNA病毒可通過灰飛虱（Laodelphax striatellus）在水稻、小麥和玉米宿主之間遷移傳播，分別導致水稻黑條矮縮病、小麥矮縮病和玉米粗縮病，威脅糧食作物生產。研究結果表明4個核酸檢測系統(tǒng)對包含這些病原體DNA或RNA的田間實際樣本粗提物檢測靈敏，且可利用LUYOR-3415小型手持式熒光儀或Strip試紙條田間現(xiàn)場定性讀取結果，也可以在實驗室開展定量分析。此外，以禾谷鐮孢與擬輪枝鐮孢菌復合侵染為樣本，建立了基于Cas12/Cas13聯(lián)合應用的復合檢測，實現(xiàn)一個檢測多種病原診斷判讀，進一步拓展了檢測工具的應用場景與潛力。由于快速基于病原體基因組信息找到特征性的靶標核酸序列，該工具為當前仍無有效診斷技術的病原體檢測提供了、低成本的開發(fā)途徑。此外，該系列檢測方法還可應用于食品安全質量檢驗、動植物檢疫、轉基因檢測、動植物群體的基因分型與基因表達檢測，具有重要的應用價值。