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顯微鏡的八種觀察方式

閱讀：0          發(fā)布時間：2019/11/11

方式一明視野觀察（Bright field, BF）

明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式，廣泛應(yīng)用于病理、檢驗，用于觀察被染色的切片，所有顯微鏡均能完成此功能。

方式二 暗視野觀察（Dark field）

暗視野實際是暗場照明。它的特點和明視野不同，不直接觀察到照明的光線，而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線。因此，視場為黑暗的背景，而被檢物體則呈現(xiàn)明亮的像。

暗視野的原理是根據(jù)光學(xué)上的丁道爾現(xiàn)象，微塵在強光直射通過的情況下，人眼不能觀察，這是因為強光繞射造成的。若把光線斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了體積，為人眼可見。暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡。它的特點是不讓光束由下至上的通過被檢物體，而是將光線改變途徑，使其斜射向被檢物體，使照明光線不直接進入物鏡，利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖像。暗視野觀察的分辨率遠(yuǎn)高于明視野觀察，達0.02-0.004μm。

方式三 相差鏡檢法（Phase contrast, PH）

在光學(xué)顯微鏡的發(fā)展過程中，相差鏡檢法的發(fā)明成功，是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就。我們知道，人眼只能區(qū)分光波的波長（顏色）和振幅（亮度）。對于無色透明的生物標(biāo)本，當(dāng)光線通過時，波長和振幅變化不大，在明場觀察時很難觀察到標(biāo)本。

相差顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢，也就是有效的利用光的干涉現(xiàn)象，將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?，即使是無色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見。這大大便利了活體細(xì)胞的觀察，因此相差鏡檢法廣泛應(yīng)用于倒置顯微鏡。

相差顯微鏡的基本原理是，把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減小，提高反差。在構(gòu)造上，相差顯微鏡又不同于普通光學(xué)顯微鏡，具有兩個特殊之處：

（1）環(huán)形光闌（annular diaphragm）位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。

（2）相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

①A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加明亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）。

②B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更暗。

方式四 微分干涉鏡檢術(shù)（DIC）

微分干涉鏡檢術(shù)出現(xiàn)于60 年代，它不僅能觀察無色透明的物體，而且圖像呈現(xiàn)出浮雕狀的立體感，并具有相襯鏡檢術(shù)所不能達到的某些優(yōu)點，觀察效果更為逼真。

原理：微分干涉鏡檢術(shù)是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強度相等，光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象，使圖像呈現(xiàn)出立體的三維感覺。

DIC 顯微鏡的物理原理*不同于相差顯微鏡，技術(shù)設(shè)計要復(fù)雜得多。DIC 利用的是偏振光，有四個特殊的光學(xué)組件：偏振器（polarizer）、DIC 棱鏡、DIC 滑行器和檢偏器（analyzer）。偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面，使光線發(fā)生線性偏振。在聚光器中則安裝了偌瑪斯基棱鏡，即DIC 棱鏡，此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x 和y），二者成一小夾角。聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。*初兩束光相位一致，在穿過標(biāo)本相鄰的區(qū)域后，由于標(biāo)本的厚度和折射率不同，引起兩束光發(fā)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個偌瑪斯基棱鏡，即DIC 滑行器，它把兩束光波合并成一束。這時兩束光的偏振面（x 和y）仍然存在。*后光束穿過第二個偏振裝置，即檢偏器。在光束形成目鏡DIC 影像之前，檢偏器與偏光器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發(fā)生干涉。x 和y 波的光程差決定著透光的多少。光程差值為0 時，沒有光穿過檢偏器；光程差值等于波長一半時，穿過的光達到值。于是在灰色的背景上，標(biāo)本結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出明暗差。為了使影像的反差達到*佳狀態(tài)，可通過調(diào)節(jié)DIC 滑行器的縱行微調(diào)來改變光程差，光程差可改變影像的亮度。調(diào)節(jié)DIC 滑行器可使標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影形象，通常是一側(cè)亮，而另一側(cè)暗，這便造成了標(biāo)本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕。

方式五 偏光顯微鏡（Polarizing Microscopy, POL）

偏光顯微鏡是用于研究所謂透明與不透明各向異性材料的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質(zhì)，在偏光顯微鏡下就能分辨清楚，當(dāng)然這些物質(zhì)也可用染色法來進行觀察，但有些則不可能，而必須利用偏光顯微鏡。

（1）偏光顯微鏡的特點

將普通光改變?yōu)槠窆膺M行鏡檢的方法，以鑒別某一物質(zhì)是單折射（各向同性）或雙折射性（各向異性）。雙折射性是晶體的基本特性。因此，偏光顯微鏡被廣泛的應(yīng)用在礦物、化學(xué)等領(lǐng)域，在生物學(xué)和植物學(xué)也有應(yīng)用。

（2）偏光顯微鏡的基本原理

偏光顯微鏡的原理比較復(fù)雜，在此不做過多介紹，偏光顯微鏡必須具備以下附件：起偏鏡，檢偏鏡，補償器或相位片，無應(yīng)力物鏡，旋轉(zhuǎn)載物臺。

（3）偏光鏡檢術(shù)的方式

①正相鏡檢（Orthscope）：又稱無畸變鏡檢，其特點是使用低倍物鏡，不用伯特蘭透鏡（BertrandLens），被研究對象可直接用偏振光研究。同時為使照明孔徑變小，推開聚光鏡的上透鏡。正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。

②錐光鏡檢（Conoscope）：又稱干涉鏡檢，研究在偏振光干涉時產(chǎn)生的干涉圖樣，這種方法用于觀察物體的單軸性或雙軸性。在該方法中，用強會聚偏振光束照明。

（4）偏光顯微鏡在裝置上的要求

①光源：采用單色光，因為光的速度、折射率和干涉現(xiàn)象由于波長的不同而有差異。一般鏡檢可使用普通光。

②目鏡：要帶有十字線的目鏡。

③聚光鏡：為了取得平行偏光，應(yīng)使用能推出上透鏡的搖出式聚光鏡。

④伯特蘭透鏡：聚光鏡光路中的輔助部件，這是把物體所有造成的初級相放大為次級相的輔助透鏡。它可保證用目鏡來觀察在物鏡后焦平面中形成的平涉圖樣。

（5）偏光鏡檢術(shù)的要求

①載物臺的中心與光軸同軸。

②起偏鏡和檢偏鏡應(yīng)處于正交位置。

③制片不宜過薄。

（6）典型應(yīng)用圖例

方式六 霍夫曼調(diào)制相襯（HMC）

原理是利用斜射光照射，它將相位梯度轉(zhuǎn)換為光強度變化，這樣可以用來觀察未經(jīng)染色的樣品和活細(xì)胞。這項技術(shù)可以視厚樣品觀察有立體感。羅伯特霍夫曼博士在1975 年發(fā)明這項技術(shù)。

HMC 照明的一個例子是使用在體外受精實驗中，其中光照下幾乎透明的卵母細(xì)胞是很難看清楚。所以HMC 沒有DIC 的效果好。

HMC的系統(tǒng)通常包括一個帶狹縫的聚光鏡和帶狹縫的物鏡。聚光鏡里還有一個可以旋轉(zhuǎn)的起偏器。根據(jù)HMC的原理一些顯微鏡制造商引進該技術(shù)的變種，例如尼康的調(diào)制相襯（NAMC），奧林巴斯的浮雕相襯（RC）和徠卡的集成霍夫曼調(diào)制相襯（IMC）。

方式七 熒光顯微鏡（Fluorescence Microscopy, FL）

    熒光鏡檢術(shù)是用短波長的光線照射用熒光素標(biāo)記過的被檢物體，使之受激發(fā)后產(chǎn)生長波長的熒光，然后觀察。

（1）優(yōu)勢：

①檢出能力高（放大作用）

②對細(xì)胞的刺激小（可以活體染色）

③能進行多重染色

（2）用途：

①物體構(gòu)造的觀察——熒光素

②熒光的有無、色調(diào)比較進行物質(zhì)判別——抗體熒光等

③發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析。