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摘要

制備液相色譜技術(shù)作為一種能獲得高純度化合物的分離技術(shù)，近年來發(fā)展很快。與常規(guī)分析液相色譜相比，制備液相色譜的目的不是為了了解混合物中各個化合物的組成，而是通過色譜方法對混合物中各組分進(jìn)行分離并分別收集，此時需要考慮的是收集組分的純度、回收率、操作時間、溶劑消耗等。制備液相色譜又分為高壓制備液相色譜和中低壓制備液相色譜，前者分離效率很高，所獲得樣品純度和回收率都較高，但同時也存在上樣量小、儀器復(fù)雜且昂貴等缺點(diǎn)；而后者因其固有的分離過程快速、上樣量大、儀器簡單成本低廉等優(yōu)勢，目前在藥物合成、天然產(chǎn)物提取、精細(xì)化工等領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用。

對于廣大小分子藥物合成人員而言，他們的研究工作中常常遇到這樣的一類樣品，即樣品具有很高的極性或親脂性，對于這類樣品的分離純化，一般不宜采用正相分離模式，原因在于樣品可能會與正相分離柱中的硅膠固定相產(chǎn)生很強(qiáng)的相互作用從而導(dǎo)致無法洗脫。而反相分離模式則可以很好的滿足此類樣品的分離純化要求，因而反相分離純化正在獲得越來越廣泛的應(yīng)用。本文主要探索的是反相分離純化方法的放大，反相分離方法的建立通?；诜治鲂虷PLC的分離結(jié)果，通過對分離條件進(jìn)行調(diào)整，然后將方法轉(zhuǎn)移到4 g、12 g或者25 g反相快速分離柱（以下簡稱Flash柱）上進(jìn)行小量樣品的分離，進(jìn)一步優(yōu)化分離方法，zui后將優(yōu)化的方法放大至更大規(guī)格的Flash柱，從而達(dá)到分離純化大量樣品的目的。

實(shí)驗(yàn)部分

本文基于常州三泰科技公司生產(chǎn)的SepaFlash®鍵合相系列Flash柱進(jìn)行分離純化方法放大的探索，該系列產(chǎn)品的填料的基質(zhì)為球形硅膠，硅膠表面鍵合相為C18，硅膠粒徑為20 - 45 μm,孔徑為100 Å，下表為該系列產(chǎn)品的具體規(guī)格參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)主要用到的產(chǎn)品規(guī)格為25 g、80 g及120 g。

表1. SepaFlash® Bond Series C18系列反相柱參數(shù)

（填料:High efficiency spherical C18, 20-45μm, 100Å）

1. 樣品

我們采用一組標(biāo)準(zhǔn)品混合物對分離純化方法放大實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了初步探索，稱取組份A（0.1 g）、組份B（0.4 g）及組份C（7.5 g）溶于100 ml甲醇溶液中，充分混合均勻后待用，混合物樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1. 混合物樣品各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2. 上樣量與Flash柱的選擇

分離純化方法放大主要是對待純化樣品的上樣量進(jìn)行放大，更大的上樣量需要在更大規(guī)格的Flash柱上才能實(shí)現(xiàn)，一般來說反相Flash柱的上樣量是其填料量的0.5%-1%左右，對于某些易分離的樣品，其上樣量可以超過1%填料量這個限制，因此，在實(shí)際研究中還需要根據(jù)樣品性質(zhì)對上樣量進(jìn)行調(diào)整。

3. 實(shí)驗(yàn)參數(shù)及結(jié)果討論

實(shí)驗(yàn)過程中所用到的Flash柱規(guī)格分別為25 g和80 g，首先利用25 g Flash柱對1.2 ml混合物樣品進(jìn)行了分離純化，實(shí)驗(yàn)參數(shù)參見表2，所得分離圖譜如圖2所示。在上樣量為96 mg的情況下，相當(dāng)于25g Flash填料量的0.4%，此時的分離圖譜顯示混合物樣品得到了基線分離，且從各組分的分離度來看0.4%的上樣比例還有較大的提升空間。根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們僅對流速進(jìn)行了調(diào)整，而洗脫梯度等條件保持不變，我們進(jìn)一步地利用80 g Flash柱對4 ml混合物樣品進(jìn)行了分離純化，所得分離圖譜如圖3所示。從圖3可以看出，保持與之前25 g規(guī)格Flash柱小試時同樣的上樣比例，可以獲得十分一致的分離圖譜，提示我們該放大方法對于此類樣品有著可以預(yù)期的分離效果。

表2. 標(biāo)準(zhǔn)品Flash分離純化實(shí)驗(yàn)參數(shù)

圖2. 標(biāo)準(zhǔn)品混合物在25 g Flash柱上的分離圖譜

圖3. 標(biāo)準(zhǔn)品混合物在80 g Flash柱上的分離圖譜

因此，我們處理樣品量比較大的分離純化任務(wù)時，可以先選用一根小規(guī)格的Flash柱進(jìn)行小量樣品的分離純化，優(yōu)化分離方法；然后選擇一根大規(guī)格的同系列Flash柱進(jìn)行上樣量放大后的分離純化，設(shè)置好相應(yīng)的流速，將優(yōu)化的分離方法導(dǎo)入，無需再次摸索分離方法，即可實(shí)現(xiàn)大量樣品的分離純化，從而大大節(jié)約寶貴的時間，降低溶劑消耗，提高工作效率。

4. 方法驗(yàn)證

圖4. 某合成反應(yīng)zui后一步，右側(cè)為目標(biāo)產(chǎn)物

為了驗(yàn)證反相Flash柱分離方法放大的實(shí)際效果，我們選擇了某合成反應(yīng)的zui后一步產(chǎn)物作為樣品，通過上樣量的放大，檢驗(yàn)放大方法的實(shí)際分離效果。待純化樣品為如圖4所示的合成反應(yīng)產(chǎn)物，從結(jié)構(gòu)式可知其極性很高，必須采用反相柱才能對其進(jìn)行分離純化。此外，由于合成反應(yīng)會生成不需要的副產(chǎn)物，因此需要將目標(biāo)產(chǎn)物從副產(chǎn)物等雜質(zhì)中分離純化出來，且目標(biāo)產(chǎn)物的純度應(yīng)大于95%。

取合成產(chǎn)物樣品1.25 g，溶解于10.0 ml甲醇中，充分混勻后待用。Flash分離純化實(shí)驗(yàn)參數(shù)參見表3，具體分離方法見下表，所得分離圖譜如圖5及圖6所示。

表3. 合成產(chǎn)物Flash分離純化實(shí)驗(yàn)參數(shù)

圖5. 合成產(chǎn)物在25 g Flash柱上的分離圖譜

圖6. 合成產(chǎn)物在120 g Flash柱上的分離圖譜

由圖5及圖6可知，在實(shí)際樣品的分離純化方法放大過程中，僅需設(shè)置好與不同規(guī)格Flash柱相適應(yīng)的流速，無需對其他參數(shù)進(jìn)行改動，即可獲得良好的分離效果，且兩個分離圖譜中目標(biāo)物及其他雜質(zhì)的保留時間及峰形等色譜參數(shù)保持一致，從而表明了放大方法的重現(xiàn)性及可靠性。經(jīng)HPLC分析，F(xiàn)lash分離純化zui終獲得目標(biāo)產(chǎn)物的純度>95%，可以滿足對目標(biāo)產(chǎn)物純度的要求。

結(jié)論

在本應(yīng)用案例中，合成產(chǎn)物的上樣量從162 mg放大至1.0 g，放大倍數(shù)為6倍，對應(yīng)的Flash柱規(guī)格從25 g擴(kuò)大至120 g，在此條件下對樣品的分離純化獲得了良好的分離度及重現(xiàn)性。這一結(jié)果表明：利用SepaFlash®反相Flash柱，配合SepaBeanTM machine，可以實(shí)現(xiàn)對高極性樣品分離純化方法的放大，且整個方法放大過程無需改變其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)，簡單便捷，為廣大實(shí)驗(yàn)室科研人員在從事相關(guān)課題時提供了一種的解決方案。

關(guān)于SepaFlash® Bonded Series C18反相柱系列產(chǎn)品

常州三泰科技公司SepaFlash® Bond Series C18反相柱系列產(chǎn)品具有多種規(guī)格（參見表4）。

表4. SepaFlash® Bond Series C18系列反相柱參數(shù)

（填料:High efficiency spherical C18, 20-45μm, 100Å）

（本文作者為CBG應(yīng)用技術(shù)研究中心：錢美圓，徐波。有任何疑問，都可以和我們一起探討）