国产精品成人网站,精品人妻互换一区二区三区,大肉大捧一进一出视频免费的试看,婷婷激情综合网

應(yīng)用技術(shù)研究中心

仇偉，徐波

Flash純化柱是Flash純化體系的心臟，好比汽車?yán)锏陌l(fā)動(dòng)機(jī)。工欲善其事，必先利其器，挑選正確的Flash純化柱是整個(gè)純化zui為關(guān)鍵的一環(huán)。而挑選合適的Flash純化柱就像茫茫的人海中挑選另一半一樣，高矮胖瘦、外貌、內(nèi)涵品質(zhì)各方面都要細(xì)細(xì)斟酌考慮。今天我們就聊聊純化柱的內(nèi)涵——固定相。

圖1. 常州三泰科技有限公司SepaFlash系列純化柱產(chǎn)品

固定相也就是俗稱的填料，是色譜中zui為核心的部分。要確定Flash純化柱裝填的固定相，就要依次確定固定相三個(gè)方面的信息：基質(zhì)種類、表面修飾/鍵合相、基質(zhì)參數(shù)。

一、基質(zhì)

基質(zhì)是固定相構(gòu)成的基本材料，常用的基質(zhì)材料分為三大類：無(wú)機(jī)材料、有機(jī)材料以及復(fù)合材料。無(wú)機(jī)材料有：硅膠、氧化鋁等；有機(jī)材料主要是凝膠等聚合物材料；復(fù)合材料通常是指無(wú)機(jī)材料與有機(jī)材料通過(guò)雜化、涂覆、包覆等手段相結(jié)合的復(fù)合材料。

硅膠是在Flash純化中應(yīng)用zui廣泛的基質(zhì)，色譜用硅膠是多孔結(jié)構(gòu)，具有高機(jī)械強(qiáng)度以及熱穩(wěn)定性，優(yōu)良的孔結(jié)構(gòu)和比表面積，其表面含有大量的活性羥基，在正相純化體系中對(duì)化合物的分離純化起到非常重要的作用。同時(shí)硅膠表面容易修飾形成其他鍵合類固定相，以硅膠基質(zhì)修飾而成的固定相種類繁多，且分離純化效果相比其他基質(zhì)好很多。但硅膠基質(zhì)在堿性條件下穩(wěn)定性比較差，同時(shí)其羥基的存在對(duì)一些物質(zhì)尤其對(duì)堿性物質(zhì)容易造成不可逆吸附，此外在應(yīng)用于一些生物分子樣品的分離純化時(shí)會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生非特異性吸附或使樣品變性，造成色譜圖中樣品洗脫的峰型變差以及樣品回收率降低。

氧化鋁基質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度高，化學(xué)穩(wěn)定好，對(duì)一些化合物具有*的選擇性，對(duì)硅膠基質(zhì)來(lái)說(shuō)具有很好的互補(bǔ)性。但氧化鋁表面修飾比較困難，所以zui多還是應(yīng)用于正相純化體系，少量應(yīng)用在離子交換體系。

有機(jī)基質(zhì)多是聚合物凝膠材料（如樹(shù)脂、聚苯乙烯二乙烯共聚物等），與硅膠相比有更好的化學(xué)穩(wěn)定性（適用pH值范圍可以從1到12），與待分離的樣品基本不發(fā)生變性反應(yīng)，也不容易產(chǎn)生不可逆吸附。通過(guò)修飾后應(yīng)用在離子交換色譜、體積排阻色譜和反相疏水色譜等模式下，在蛋白質(zhì)、糖類等生物分子的分離純化方面有著廣泛的應(yīng)用。但相比較硅膠等無(wú)機(jī)基質(zhì)來(lái)說(shuō)，有機(jī)基質(zhì)固定相能耐受的分離機(jī)械強(qiáng)度較低，分離純化效果較差，限制了其在純化方面的應(yīng)用范圍。

復(fù)合基質(zhì)是兼容并中和了無(wú)機(jī)基質(zhì)和有機(jī)基質(zhì)的優(yōu)缺點(diǎn)，但一般復(fù)合基質(zhì)相應(yīng)的固定相都是價(jià)格昂貴，所以在制備純化方面應(yīng)用較少。

二、表面修飾/鍵合相

通過(guò)對(duì)基質(zhì)進(jìn)行修飾或者鍵合不同的基團(tuán)，形成了不同分離類型的固定相，通常包括：正相、反相、離子交換、尺寸排阻、手性等等固定相。

基質(zhì)上修飾的基團(tuán)極性大于流動(dòng)相的極性的色譜模式稱之為正相色譜，依靠樣品極性不同在固定相和流動(dòng)相產(chǎn)生分配的作用達(dá)到分離的目的。這種分離模式下，樣品按照極性從弱到強(qiáng)依次從純化柱上被洗脫下來(lái)。常用正相固定相包括：未修飾的硅膠；二醇基、氨基、氰基等硅膠基質(zhì)固定相；氧化鋁等。正相硅膠固定相主要應(yīng)用在合成非極性或中等極性中間體等的初步純化，常規(guī)的流動(dòng)體系為正己烷/乙酸乙酯、二氯甲烷/甲醇等。其優(yōu)點(diǎn)是純化簡(jiǎn)單、樣品后處理簡(jiǎn)單；缺點(diǎn)是分離性能不高（與反相固定相比較），重現(xiàn)性較差，且吸附性較強(qiáng)甚至對(duì)某類物質(zhì)產(chǎn)生不可逆吸附。此外，一些極性基團(tuán)（二醇基、氨基、氰基等）鍵合的正相固定相經(jīng)常應(yīng)用在反相條件下，對(duì)于在C18等反相固定相保留不強(qiáng)的極性化合物，可以獲得很好的分離純化效果。

氧化鋁固定相分為酸性、中性、堿性三種。酸性氧化鋁一般利用酸性溶劑進(jìn)行預(yù)處理，具有微弱陽(yáng)離子特性，表面更易保留中性和帶負(fù)電荷的物質(zhì)，不能很好地保留帶正電荷的物質(zhì)，主要應(yīng)用在酸性色素、醛類、酸類化合物的分離純化。堿性氧化鋁通常利用堿性溶液進(jìn)行預(yù)處理，具有陰離子特性并有陽(yáng)離子交換功能，對(duì)極性陽(yáng)離子樣品具有強(qiáng)吸附作用，主要應(yīng)用于堿性色素、生物堿等堿性物質(zhì)的分離純化。而中性氧化鋁對(duì)樣品的酸堿性不敏感，主要應(yīng)用于苷、醛類和酯類等酸堿不穩(wěn)定化合物。

基質(zhì)上修飾的基團(tuán)極性小于流動(dòng)相極性的色譜模式稱之為反相色譜，這種分離模式下，樣品被洗脫下來(lái)的順序與正相模式正好相反：樣品按照極性從強(qiáng)到弱依次被洗脫下來(lái)。反相固定相多是以硅膠基質(zhì)鍵合不同鍵合相如C18、C8、C4、C1、苯基等固定相，廣泛應(yīng)用在天然產(chǎn)物、多肽以及蛋白質(zhì)等樣品的精制純化方面，具有分離效果、重現(xiàn)性好、使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)。

尺寸排阻色譜（Size Exclusion Chromatography，SEC）是一種根據(jù)樣品分子體積（流體力學(xué)體積）的大小進(jìn)行分離的色譜模式（參見(jiàn)圖2）。SEC可以細(xì)化分為凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography, GPC）和凝膠過(guò)濾色譜（Gel Filtration Chromatography, GFC），基質(zhì)不同，故使用的流動(dòng)相也不相同。GPC目前主要的基質(zhì)是交聯(lián)PS(苯乙烯-二乙烯基苯聚合物)、交聯(lián)PVAC（交聯(lián)聚乙酸乙烯酯），不同基質(zhì)用不同的有機(jī)溶劑（DMF等）作為流動(dòng)相，主要應(yīng)用于合成有機(jī)高分子聚合物的分離純化。GFC主要基質(zhì)是表面親水處理的硅膠以及交聯(lián)葡聚糖、交聯(lián)聚丙烯酰胺等等，流動(dòng)相主要是水，所以GFC比較多的應(yīng)用在蛋白純化。尺寸排阻模式主要的缺點(diǎn)是載樣量很小，且流速通常比較低，所以制備效率差；而其分離模式簡(jiǎn)單、高回收率是它在制備純化方面的優(yōu)勢(shì)。

圖2. SEC分離模式示意圖（摘自GE蛋白純化分離手冊(cè)）

離子交換色譜是通過(guò)樣品分子表面離子電荷與色譜填料表面離子電荷互相作用而達(dá)到分離的模式（參見(jiàn)圖3）。固定相表面呈正電荷，對(duì)陰離子有保留的稱為陰離子交換填料；固定相表面呈負(fù)電荷，對(duì)陽(yáng)離子有保留的稱為陽(yáng)離子交換填料。此外根據(jù)填料表面離子結(jié)合狀態(tài)的強(qiáng)弱還分為強(qiáng)離子交換填料和弱離子交換填料。陽(yáng)離子交換填料常見(jiàn)的表面基團(tuán)為磺酸基（強(qiáng)陽(yáng)離子交換）、磷酸基、羧酸基、酚羥基；陰離子交換填料常見(jiàn)的表面基團(tuán)為伯胺基、仲胺基、叔胺基、季胺基（強(qiáng)陰離子交換填料）。而離子交換填料應(yīng)用于制備純化時(shí)通常采用的基質(zhì)是樹(shù)脂，而分析應(yīng)用中出于壓力和分辨率方面的考慮硅膠基質(zhì)和無(wú)孔凝膠比較多。

圖3. 陰離子交換模式示意圖（摘自GE蛋白純化分離手冊(cè)）

手性固定相是將多糖、環(huán)糊精、蛋白等衍生物鍵合或者涂覆到硅膠等基質(zhì)上的固定相，對(duì)手性物質(zhì)進(jìn)行手性識(shí)別拆分，達(dá)到分離純化的目的。由于手性固定相非常昂貴，為了盡量保護(hù)固定相，一般對(duì)樣品化學(xué)純度要求比較高，通常樣品都經(jīng)過(guò)初步純化，提高化學(xué)純度，除去易對(duì)固定相造成損傷或吸附的雜質(zhì)。

三、基質(zhì)參數(shù)

基質(zhì)參數(shù)包括基質(zhì)的形狀、粒徑以及孔徑等，這些參數(shù)要結(jié)合純化方面的具體需求進(jìn)行選擇。

以應(yīng)用zui廣泛的硅膠基質(zhì)為例，應(yīng)用于制備純化方面的硅膠基質(zhì)通常分為球形和無(wú)定型兩種（參見(jiàn)圖4）。無(wú)定型硅膠價(jià)格低廉，是初步粗純的。與無(wú)定型硅膠相比，球型硅膠優(yōu)勢(shì)非常明顯，具有以下優(yōu)點(diǎn)：顆粒均一性好，裝填后柱床穩(wěn)定不容易塌陷，多路擴(kuò)散效應(yīng)低，柱效高，分離度好。但其價(jià)格稍微昂貴一點(diǎn)，一般應(yīng)用在精制純化階段。

圖4. 無(wú)定型硅膠與球形硅膠電鏡圖

基質(zhì)粒徑大小直接影響柱效和分離效果，越小的粒徑所能達(dá)到的柱效越高，而選擇粒徑要具體看樣品的分離狀況，畢竟制備要考慮成本問(wèn)題，越小粒徑的固定相價(jià)格越昂貴，為了達(dá)到的柱效通常越小粒徑選擇的線流速就越大，所以背壓越高，對(duì)儀器要求也高。一般粗純的時(shí)候多選擇大顆粒固定相，而當(dāng)樣品附加值高，要求高純度和高得率的情況下，大多選擇小粒徑固定相。所以選擇固定相粒徑要從成本、樣品以及純化設(shè)備參數(shù)等方面綜合考慮。圖5所示為不同粒徑分離效果對(duì)比的案例。

圖5. 某中間體的分離效果圖（左圖所用Flash柱規(guī)格為25g 正相標(biāo)準(zhǔn)快速分離硅膠柱，粒徑40–63 µm；

右圖所用Flash柱規(guī)格為25g 正相快速分離硅膠柱，粒徑25–40 µm）

多孔固定相基質(zhì)孔徑的選擇主要是從樣品的分子體積去考慮（表1總結(jié)了樣品分子量、樣品分子直徑以及推薦孔徑之間的關(guān)系），固定相的孔徑通常要大于樣品分子體積的三倍，才能使樣品分子有效進(jìn)入固定相孔內(nèi)進(jìn)行充分的接觸達(dá)到分離效果。但是對(duì)于多肽類樣品分子而言，由于其分子結(jié)構(gòu)呈長(zhǎng)鏈狀，因而固定相的孔徑不必滿足上述規(guī)律。同時(shí)孔徑還與比表面積有關(guān)，其他參數(shù)一樣的情況下孔徑越小比表面積越大，而比表面積的大小在一定程度上影響分離效果和上樣情況，通常比表面積大代表表面修飾的基團(tuán)多，那么分離效果就越好，載樣量也越大。

表1. 樣品分子量、樣品分子體積以及對(duì)應(yīng)的推薦孔徑

四、總結(jié)

綜上所述，在進(jìn)行樣品的Flash純化制備時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際的制備需求，結(jié)合樣品性質(zhì)、對(duì)產(chǎn)物純度和得率方面的要求以及儀器配置等方面的實(shí)際情況，從基質(zhì)、表面修飾/鍵合相以及基質(zhì)參數(shù)三個(gè)方面綜合考慮，zui終確定純化制備zui適用的固定相。