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1.構(gòu)建CaM誘餌質(zhì)粒

① PCR 擴(kuò)增CaM基因的開放閱讀框，正向和反向引物分別加接酶切位點(diǎn)。

② 擴(kuò)增得到的CaM插入t載體( T–CaM) 。

③ T–CaM和pGBKT7 質(zhì)粒分別雙酶切。

④ 膠回收目的DNA。

⑤ 將CaM連入pGBKT7，構(gòu)建成表達(dá)載體pGBKT-CaM，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。

⑥ 因pGBKT7含Kan+抗性基因，在Kan+抗性平板上篩選陽性克隆。

⑦ 測序驗(yàn)證CaM與gal4 DNA 結(jié)合功能區(qū)融合，插入序列讀框正確、無堿基突變。

2.pGBKT7 – CaM轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold

將pGBKT7- CaM采用PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold，涂布于SD – Trp固體培養(yǎng)基上，30° C 3-5天，菌落長出。

進(jìn)行CaM自激活鑒定及毒性測定。

3.龍須菜高溫脅迫表達(dá)cDNA文庫構(gòu)建

① 設(shè)定溫度梯度(26-35°C)和時(shí)間梯度(12-72 h)，對龍須菜進(jìn)行高溫脅迫。

② 提取龍須菜總RNA(RNA提取按照Qiagen試劑盒說明書進(jìn)行，RNeasy Plant Mini Kit，Qiagen)。

③ 應(yīng)用SMART技術(shù)構(gòu)建龍須菜高溫脅迫表達(dá)cDNA文庫，3’和5’引物分別加接酶切位點(diǎn)。

4.文庫篩選載體構(gòu)建

將龍須菜高溫脅迫表達(dá)文庫cDNA雙酶切，連入同樣雙酶切的AD 克隆質(zhì)粒pGADT7中，用PEG/LiAc 轉(zhuǎn)化法將cDNA 文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌Y187中，SD – Leu平板上30 ℃培養(yǎng)3～5 天，菌落長出。

5.酵母交配轉(zhuǎn)化及陽性克隆的篩選

將酵母菌Y187/ pGADT7-cDNA與酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM進(jìn)行酵母交配轉(zhuǎn)化(Yeast Mating)，SD–Trp/-Leu/Aba/X-α-gal平板上30 ℃培養(yǎng)3～5 天，篩選藍(lán)色菌落，再將陽性克隆在SD–Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba/X-α-gal平板上進(jìn)行驗(yàn)證。

6.陽性克隆質(zhì)粒的提取和保存

提取陽性克隆酵母菌的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli DH5α中，因pGADT7質(zhì)粒含Amp+ 抗性基因，在Amp+抗性平板上篩選陽性克隆AD- X(X代表陽性克隆中攜帶的龍須菜cDNA，即為初步篩選得到的相互作用蛋白質(zhì)的cDNA)。

7.陽性克隆的再驗(yàn)證

pGBKT7 –CaM 與AD–X質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold，重新驗(yàn)證相互作用消除假陽性。按表1組合，轉(zhuǎn)化后的酵母菌涂布于SD–Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba/X-α-gal平板上，30 ℃培養(yǎng)5～7 天，篩選藍(lán)色克隆而且無自激活性的蛋白即為相互作用的蛋白。

表1 　陽性克隆再驗(yàn)證的質(zhì)粒組合方案

8.對相互作用蛋白X進(jìn)行測序和序列分析

以pGADT7載體引物對AD–X進(jìn)行測序，測序結(jié)果與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析和序列結(jié)構(gòu)分析。

心得經(jīng)驗(yàn)：

酵母雙雜交系統(tǒng)對于研究蛋白與蛋白之間的相互作用雖然具有篩選量大、效率高及應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，但有它自身的缺陷。酵母培養(yǎng)的周期與大腸桿菌相比較長，酵母轉(zhuǎn)化的過程較繁復(fù)，耗時(shí)較長，而且存在假陽性較多的問題，陽性克隆工作量太大，驗(yàn)證工作繁重。在此項(xiàng)目中酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)zui關(guān)鍵的步驟是酵母培養(yǎng)時(shí)間的掌控。在吸取5uL轉(zhuǎn)入含50mL YPDA液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃120rpm/min振蕩培養(yǎng)的步驟中其OD600達(dá)到0.15-0.3(16-20h)很重要，這關(guān)系到酵母細(xì)胞的濃度及生長狀態(tài)。且下一步把沉淀下來的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入含100mLYPDA液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃120rpm/min振蕩培養(yǎng)達(dá)到其OD600達(dá)到0.4-0.5(3-5h)同樣重要。在這3-5h培養(yǎng)的原因是讓細(xì)胞至少完成兩次分裂，而且在細(xì)胞3-4次分裂間，轉(zhuǎn)化效率恒定。在酵母交配實(shí)驗(yàn)中，30 ℃、80r/min恒溫振蕩培養(yǎng)時(shí)間20-24h也甚為重要，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)由在顯微鏡下是否能看到米奇頭形狀的雜交細(xì)胞為準(zhǔn)，如果沒有觀察到雜交細(xì)胞，應(yīng)適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間，而如果觀察到，應(yīng)停止振蕩培養(yǎng)，防止雜交細(xì)胞增殖，增加篩選工作量。培養(yǎng)酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM(SD/-Trp)時(shí)，出現(xiàn)了酵母菌種從第四天開始出現(xiàn)變紅的情況，查找資料得知是由于酵母菌在缺乏腺嘌呤的生長環(huán)境中，產(chǎn)生紅色代謝物的導(dǎo)致的。因而應(yīng)盡量縮短此步的培養(yǎng)時(shí)間。本項(xiàng)目用變紅的菌進(jìn)行下一步的步驟，實(shí)驗(yàn)結(jié)果并沒有受影響，且變紅的菌在腺嘌呤豐富的YPDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，后代菌種恢復(fù)白色。綜上，酵母培養(yǎng)時(shí)間的控制是酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

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