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      MTT完整漢語(yǔ)化學(xué)名為 3-(4，5-mtt二甲基噻唑-2)-2，五二苯基四氮唑溴鹽，商品名：mtt噻唑藍(lán)。是一種黃色彩的染料。

      MTT比色法，是一種檢查細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的辦法。其檢查原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT康復(fù)為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功用。二甲基亞砜(DMSO)，其作用是能夠溶解細(xì)胞中甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢查儀在490nm波利益測(cè)定其光吸收值就可反映活細(xì)胞數(shù)量。在必定細(xì)胞數(shù)方案內(nèi)，MTT結(jié)晶構(gòu)成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該辦法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢查、大方案的抗腫瘤藥物挑選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射活絡(luò)性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是活絡(luò)度高、經(jīng)濟(jì)。缺點(diǎn)：因?yàn)镸TT經(jīng)康復(fù)所發(fā)生的甲瓚商品不溶于水，需被溶解后才調(diào)檢查。這不只使工作量增加，也會(huì)對(duì)試驗(yàn)作用的準(zhǔn)確性發(fā)生影響，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對(duì)試驗(yàn)者也有危害。

      MTT 溶液的制作辦法

      通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因而，能夠稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液(PBS)或無(wú)酚紅的培育基中，用0.22μm濾膜過濾以除掉溶液里的細(xì)菌，放4℃ 避光保留即可。在制作和保留的進(jìn)程中，容器用鋁箔紙包住。試驗(yàn)的時(shí)分我通常封閉超凈臺(tái)上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。

需求留神的是，MTT法只能用來檢查細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)生機(jī)，但不能測(cè)定細(xì)胞必定數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢查作用的時(shí)分，為了確保試驗(yàn)作用的線性，MTT 吸光度在0-0.7 方案內(nèi)。

      MTT通?，F(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4oC避光保留兩周內(nèi)有效，或制作成5mg/ml保留在-20度長(zhǎng)期保留，防止重復(fù)凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光防止分化。我通常都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)分現(xiàn)配，直接往培育板中加，沒必要一瞬間配那么多,特別當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就必定不能再用了。

MTT有致癌性，用的時(shí)分留神,有條件帶那種通明的簿膜手套.配成的MTT需求無(wú)菌，MTT對(duì)菌很活絡(luò);往96孔板加時(shí)不避光也沒有聯(lián)絡(luò)，究竟時(shí)刻較短，或許你不放心的時(shí)分能夠把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉.

      制作MTT時(shí)用PBS(ph=7.4)溶解。PBS配方：Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4,定容1L。

通常MTT法試驗(yàn)進(jìn)程：

1：接種細(xì)胞：用含10% 胎小牛血清 得培育液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul.

2: 培育細(xì)胞：同通常培育條件，培育3-5天(可依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮托枨筇暨x培育時(shí)刻)。

3：呈色：培育3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS制作，pH=7.4)20ul.持續(xù)孵育4 h，

連續(xù)培育，留神吸棄孔內(nèi)培育上清液，關(guān)于懸浮細(xì)胞需求離心后再吸棄孔內(nèi)培育上清液。每孔加150ul DMSO，振動(dòng)10min，使結(jié)晶物充沛融解。

4：比色：挑選490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記載作用，以時(shí)刻為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

      藥物MTT法試驗(yàn)進(jìn)程

貼壁細(xì)胞：

1: 搜集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔參加100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度 1000-10000 孔，(邊際孔用無(wú)菌PBS填充)。

2: 5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),參加濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)刻，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.通常5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.主張?jiān)O(shè)5個(gè)，不然難以反響真實(shí)情況

3: 5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下查詢。

4: 每孔參加20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，持續(xù)培育4h。若藥物與MTT能夠反響，可先離心后棄去培育液，留神用PBS沖2-3遍后，再參加含MTT的培育液。

5: 連續(xù)培育，留神吸去孔內(nèi)培育液。

6: 每孔參加150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振動(dòng)10min，使結(jié)晶物充沛溶解。在酶聯(lián)免疫檢查儀OD490nm處丈量各孔的吸光值。

7: 一起設(shè)置調(diào)零孔(培育基、MTT、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培育液、MTT、二甲基亞砜)。

懸浮細(xì)胞：

1: 搜集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)度細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640(無(wú)血清)培育基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培育液稀釋 (儲(chǔ)存液100mg/ml，需預(yù)試尋覓稀釋度，1:10-1:20);③需檢查物10ul;④細(xì)胞懸液50ul(即5×104cell/孔)，共100ul參加到96孔板(邊際孔用無(wú)菌水填充)。每板設(shè)對(duì)照(加100ml 1640)2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下查詢。

3: 每孔參加10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，持續(xù)培育4 h。(懸浮細(xì)胞推薦運(yùn)用WST-1，培育4 h后可越過進(jìn)程4)，直接酶聯(lián)免疫檢查儀OD570nm(630nm校準(zhǔn))丈量各孔的吸光值)

4、離心(1000轉(zhuǎn)x10min)，留神吸掉上清，每孔參加100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振動(dòng)10 min，使結(jié)晶物充沛溶解。在酶聯(lián)免疫檢查儀OD570nm(630nm校準(zhǔn))丈量各孔的吸光值。

5、一起設(shè)置調(diào)零孔(培育基、MTT、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培育液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定3復(fù)孔。

留神事項(xiàng)：

      (1) 挑選適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。

      (2) 防止血清干擾：通常選小于10%的胎牛血清的培育液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)剩下培育液。

      (3) 設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培育液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)進(jìn)程保持一致，究竟比色以空白調(diào)零。

      (4) MTT試驗(yàn)吸光度究竟要在0-0.7之間，超出這個(gè)方案就不是直線聯(lián)絡(luò)。

      (5) 用96孔板培育細(xì)胞做MTT測(cè)細(xì)胞生機(jī),應(yīng)當(dāng)加多少1640培育基,多少M(fèi)TT和DMSO適合依據(jù)書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培育液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測(cè)定

      (6) 通常每孔4000個(gè)細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個(gè)/ml，MTT加20ul，作用四小時(shí)后洗掉上清液，留神不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振動(dòng)10分鐘，然后測(cè)吸光值。