昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒 pFastBac1-C-EGFP，全稱為pFastBac1-PreScission-C-EGFP-His-tag-Strep-tag，以pFastBac1為基礎(chǔ)構(gòu)建的用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)目的蛋白C端融合有EGFP蛋白的質(zhì)粒。本質(zhì)粒含有polyhedrin (PH)啟動(dòng)子，可以高效啟動(dòng)目的蛋白和EGFP融合蛋白在昆蟲細(xì)胞(如Sf9和Sf21等)中的表達(dá)，其表達(dá)的EGFP有很強(qiáng)的綠色熒光，在顯微鏡下可以非常方便地觀察目的蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)EGFP的C端含有編碼8×His標(biāo)簽的序列和編碼短肽親和標(biāo)簽Strep-tag II的序列，因此可以非常便捷地使用鎳柱或Strep-Tactin系統(tǒng)進(jìn)行分離純化。同時(shí)在目的蛋白和EGFP之間含有PreScission酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)酶切去除標(biāo)簽。

和EGFP融合表達(dá)，便于觀察表達(dá)水平。采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白時(shí)，通常僅僅是根據(jù)細(xì)胞被桿狀病毒感染的外部形態(tài)來判斷目的蛋白的表達(dá)情況，因此很容易出現(xiàn)收集病毒時(shí)間過早或過晚而導(dǎo)致的目的蛋白表達(dá)水平偏低或活性下降的問題。將目的蛋白構(gòu)建成EGFP的融合表達(dá)蛋白，因?yàn)楹笳哂泻軓?qiáng)的綠色熒光，在熒光顯微鏡下可以非常方便地觀察目的蛋白的表達(dá)效果從而可以有效避免上述問題的發(fā)生。

His和Strep-tag II雙標(biāo)簽系統(tǒng)，便于分離純化。pFastBac1-C-EGFP表達(dá)的目的蛋白EGFP融合蛋白的C端含有編碼8×His標(biāo)簽的序列，因此可以非常便捷地使用鎳柱進(jìn)行分離純化，也可以使用His標(biāo)簽抗體來識(shí)別目的蛋白融合蛋白的表達(dá)。同時(shí)，本質(zhì)粒表達(dá)的目的蛋白EGFP融合蛋白的C端還含有短肽親和標(biāo)簽Strep-tag II的序列。Strep-tag II是由8個(gè)氨基酸(WSHPQFEK)構(gòu)成的短肽序列，在生理?xiàng)l件下可通過Strep-Tactin純化介質(zhì)高選擇性地對(duì)Strep-tag II融合蛋白進(jìn)行親和純化，該標(biāo)簽的純化條件比較溫和，能很好地保持目的蛋白的生物活性，并僅通過一步親和層析后就有可能獲得超過99%純度的目的蛋白。

帶有PreScission位點(diǎn)，便于去除標(biāo)簽。本質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白，在目的蛋白和EGFP蛋白之間有PreScission蛋白酶識(shí)別的八肽序列LEVLFQGP，因此在目的蛋白純化后或純化的同時(shí)可以利用PreScission蛋白酶切除目的蛋白C端的EGFP蛋白、8×His標(biāo)簽以及Strep-tag II標(biāo)簽。PreScission蛋白酶酶切發(fā)生在八肽序列的Q和G之間，如果目的蛋白基因是通過無縫克隆的方法以理想的方式克隆在PreScission酶切位點(diǎn)之后，那么目的蛋白的N端可以只留下兩個(gè)額外的氨基酸殘基GP。

pFastBac1-C-EGFP是基于Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac Baculovirus Expression System)而設(shè)計(jì)的表達(dá)載體。Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是由Luckow等人于1993年發(fā)展的一種快速而有效產(chǎn)生重組桿狀病毒的方法。該系統(tǒng)主要包括以下兩個(gè)組分：(1)用于插入目的基因的pFastBac載體，目的基因如EGFP等插入后受桿狀病毒特異性啟動(dòng)子(baculovirus-specific promoter) polyhedrin啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)；(2)含桿狀病毒穿梭載體bacmid (bMON14272, 136kb)和輔助質(zhì)粒(helper plasmid，用于表達(dá)轉(zhuǎn)座必須的轉(zhuǎn)座蛋白)的大腸桿菌DH10Bac宿主菌株(D0346)。將pFastBac重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化該菌株可發(fā)生pFastBac重組質(zhì)粒中mini-Tn7元件和bacmid上的mini-attTN7發(fā)生轉(zhuǎn)座，從而形成重組的bacmid。位點(diǎn)特異的轉(zhuǎn)座會(huì)破壞宿主的lacZα基因，從而可通過藍(lán)白斑篩選重組克隆。PCR等方法鑒定重組克隆后，提取重組的bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，可以產(chǎn)生重組桿狀病毒，并表達(dá)目的蛋白和融合蛋白。擴(kuò)增重組的桿狀病毒并感染昆蟲細(xì)胞，就可以大量表達(dá)純化目的蛋白了。

昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒為氨芐青霉su抗性。

pFastBac1-C-EGFP質(zhì)粒的主要信息如下：

pFastBac1-C-EGFP質(zhì)粒(5517bp)的圖譜如下：

pFastBac1-C-EGFP中沒有的酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that do not cut pFastBac1-C-EGFP)包括：

pFastBac1-C-EGFP中的單酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that cut pFastBac1-C-EGFP)包括：

pFastBac1-C-EGFP質(zhì)?？墒褂玫臏y序引物序列如下：

pFastbac-F primer (3995-4014): 5'-TAT TCC GGA TTA TTC ATA CC-3'

pFastBac-R primer (4909-4927): 5' -ACA AAT GTG GTA TGG CTG A-3'

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