1.1.1 細胞株

細胞凋亡檢測*耐受的肺腺癌A549細胞株 (A549-DDP)由重慶醫(yī)科大學附屬*醫(yī)院邱峰教授惠贈, A549-DDP是在人肺腺癌細胞A549的基礎上, 以*作為誘導藥物, 采用逐步遞增濃度的方法誘導獲得, 在常規(guī)培養(yǎng)中使用2 μg/mL的*維持其耐藥性狀。

1.1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基與新鮮小牛血清購自美國Gbico公司, *、MTT購自美國Sigma 公司, RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和TaqDNA 聚合酶購自TaKaRa公司, RASSF1A表達質粒購自美國Addgene公司, 轉染試劑(X-TremeGENEHp DNATransfection Regent)購自美國Roche公司, 質粒小量提取試劑盒購自Omega公司, RASSF1A一抗購自 Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 RASSF1A表達質粒的提取

添加5 mL LB培養(yǎng)基于無菌的玻璃試管, 用接種環(huán)挑取含有RASSF1A表達質粒的DH5α菌液于準備好的LB培養(yǎng)基中, 200 r/min, 37 °C搖菌12~16 h, 按質粒提取試劑盒說明書進行提取細菌質粒, 分光光度計檢測RASSF1A 表達質粒濃度和純度。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和RASSF1A表達質粒轉染A549- DDP細胞

用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)A549-DDP細胞(培養(yǎng)基加入2 μg/mL*以維持A549-DDP細胞的耐藥性狀), 37 °C、5% CO2 條件下培養(yǎng)24 h, 0.25%*消化貼壁A549-DDP細胞, 新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基中和*并收集細胞懸液, 離心棄上清, RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞, 牛鮑計數板計數, 按照每孔2×105 細胞鋪6孔板, 37 °C、5% CO2培養(yǎng)24 h; 選擇對數生*的A549-DDP細胞株, 常規(guī)細胞換液, 嚴格按照轉染試劑說明書將2 μL轉染試劑+1 μg DNA分別轉染PCMV5-RASSF1A表達質粒和PCMV5空載體, 37 °C、5% CO2培養(yǎng)24 h。

1.2.3 RNA提取和RT-PCR檢測轉染前后RASSF1A mRNA水平

參照文獻設計引物, 其中GAPDH為內參基因。Trizol法提取各組的總RNA, 分光光度法檢測RNA濃度。取400 ng總RNA用RT反應液合成*條cDNA序列, 然后按照PCR反應, 條件如下: 95 °C 預變性, 5 min; 94 °C變性, 30 s, 60 °C退火, 30 s, 72 °C 延伸30 s, 共35個循環(huán)。GAPDH以相同條件反應35個循環(huán)。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳20 min。

1.2.4 Western blot檢測轉染前后RASSF1A蛋白表達情況

用冷的PBS洗滌細胞兩遍, 加入40 μL RIPA, 4 °C, 12 000 r/min, 離心10 min。BCA試劑盒檢測蛋白濃度, 將細胞總蛋白和6×上樣緩沖液混勻, 100 °C, 5 min使蛋白變性, 進行SDS-PAGE電泳, 條件: 先80 V, 30 min; 后為100 V, 100 min。然后將聚丙烯胺凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜, 轉膜條件: 100 V, 90 min。將PVDF膜用含5% BSA的PBST封閉1 h, 一抗(1:500) 4 °C孵育過夜, 0.1%的TPBS洗3次, 用HRP標記的二抗(1:1 000)在4 °C條件下孵育1 h, 0.1%的TPBS洗3 次, 用ECL試劑盒顯色并在BIO-RAD成像儀上成像。

1.2.5 MTT法檢測細胞活力并計算IC50

選擇轉染后的A549-DDP細胞, 按照4 000/孔的初始細胞密度鋪96孔板, 每個濃度設5個平行孔, 培養(yǎng)24 h, 給予不同濃度*, *濃度如下: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 μmol/L。當細胞培養(yǎng)至20 h時, 每孔加入5 mg/mL的MTT試劑, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 然后棄去細胞培養(yǎng)液, 每孔加入150 μL DMSO, 搖床搖10 min, 然后在490 nm處比色, 計算IC50。

1.2.6 細胞克隆形成實驗

選擇轉染后的A549- DDP細胞, 按照10 000/孔的初始細胞密度鋪12孔板, 培養(yǎng)24 h給藥, 給藥濃度如下: 0, 20, 100 μmol/L。連續(xù)培養(yǎng)5天, 棄去細胞培養(yǎng)液, 用PBS洗滌2次, 然后用甲醇固定15 min, 棄去甲醇并用流水輕輕沖洗兩次, 結晶紫染色5 min, 用流水輕輕沖去染液。自然干燥后計數克隆形成數。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

選擇轉染后的A549-DDP細胞, 按照每孔200 000/孔的初始細胞密度鋪6孔板, 培養(yǎng)24 h后, 20 μmol/L*給藥, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 收集細胞, 用冷的PBS洗滌細胞3次, 2 000 r/min, 離心5 min, 收集細胞。

加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞并加入 5 μL Annexin V-EGFP混勻后, 加入5 μL Propidium Iodide, 混勻; 室溫、避光、反應15 min后, 用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況(早期凋亡與晚期細胞凋亡檢測之和)。

1.2.8 統(tǒng)計學處理

所有的實驗至少重復3次, 實驗數據用x _ ±s表示, 不同實驗組之間的比較用F檢驗, 所有的統(tǒng)計學分析均在統(tǒng)計學軟件SPSS17.0上進行, P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
對照品    含量測定    *    100012-200105        100mg
對照品    含量測定    *磷酸鈉    100016-20011A        100mg
對照品    含量測定    氨苯甲酸    100017-200308        50mg
對照品    檢查    *    100018-200408        1000mg
對照品    鑒別    *    100021-198102        200mg
對照品    HPLC法含量測定    *（曾用名：甘羅溴銨）    100022-200403        100mg
對照品    鑒別    *    100023-198601        50mg
細胞凋亡檢測