1 細(xì)胞凋亡檢測原理和方法

細(xì)胞因子的發(fā)現(xiàn)依賴于其生物學(xué)活性，因此，建立了生物分析法用于細(xì)胞因子的檢測。隨后，用于檢測實(shí)驗(yàn)溶液(如組織培養(yǎng)上清液)中細(xì)胞因子的免疫分析法被建立，并不斷用于實(shí)驗(yàn)室研究。但準(zhǔn)確地、可重復(fù)地測定細(xì)胞因子具有一定困難，主要原因是*的細(xì)胞因子的含量極低(大部分都是以pmol/L計(jì))，同時(shí)存在著源于異嗜性抗體，類風(fēng)濕因子以及特異的和非特異的細(xì)胞因子結(jié)合蛋白等[1，2] 的顯著干擾。

細(xì)胞因子生物學(xué)活性檢測和濃度測定的分析方法主要有以下幾類[3] 。

1.1 生物分析法 生物分析法方便，敏感性高，但所有細(xì)胞系有可能受幾種細(xì)胞因子的影響，特異性則較差。又由于可溶性細(xì)胞因子受體等抑制劑的存在，使生物分析法可能低估細(xì)胞因子的活性。常用的方法有2種:(1)依賴性細(xì)胞株增敏實(shí)驗(yàn)。一些腫瘤細(xì)胞株依賴于細(xì)胞因子方能在體外增殖，如TF-1細(xì)胞株依賴于GM-CSF和IL-3[4，5] ，CTLL細(xì)胞株依賴于IL-2，TTD-1細(xì)胞株依賴于IL-6等 [4] 。可利用這些依賴株檢測相應(yīng)的細(xì)胞因子。但是，并非所有細(xì)胞因子均有相應(yīng)的依賴株，因此限制了此法的應(yīng)用。(2)功能檢測實(shí)驗(yàn)。利用一些細(xì)胞因子的功能特性而建立相應(yīng)的活性測定方法。如IFN抗病毒實(shí)驗(yàn)和tnf對L 929 細(xì)胞的殺傷作用等[4] 。此外，生物分析法還有骨髓集落形成實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞毒或細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，次級分子分泌的誘導(dǎo)，化學(xué)趨化和細(xì)胞因子分泌性的抑制實(shí)驗(yàn)等。

1.2 免疫分析法 利用抗原機(jī)體反應(yīng)的原理，制備出抗細(xì)胞因子的單抗或多抗，可進(jìn)行細(xì)胞因子的免疫檢測，它包括放免實(shí)驗(yàn)(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)等。其優(yōu)點(diǎn)是高特異性、高靈敏度、操作簡便。缺點(diǎn)是不能證明被測細(xì)胞因子是否為具有完整生物活性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)而非變性蛋白質(zhì)。

1.3 CKmRNA的測定 (1)分子雜交實(shí)驗(yàn):首先制備出細(xì)胞因子的基因探針，通過分子雜交檢測細(xì)胞內(nèi)CKmRNA的表達(dá)。(2)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法技術(shù):可快速、靈敏地檢測表達(dá)很低的CKmRNA，并可同時(shí)測定同一樣本中多種CKmRNA，操作過程包括細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞的RNA提取，mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，在細(xì)胞因子引物的引導(dǎo)下，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)定量CKmRNA方法和原理的不同，可分為半定量PCR法，競爭性定量PCR法，內(nèi)參標(biāo)定量PCR法，HPLC-PCR法和酶聯(lián)免疫定量PCR法 [6] 。目前市售的商品試劑盒已能用于大多數(shù)細(xì)胞因子的檢測，但因其價(jià)格昂貴而阻礙了其廣泛使用。同時(shí)，人細(xì)胞因子的測定仍存在許多問題，檢測方法選擇不當(dāng)可能得到不一致的結(jié)果，有時(shí)有必要選擇一個(gè)以上的檢測方法測定細(xì)胞因子。

2 靈敏度

細(xì)胞因子具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，其生物分析法的靈敏度*。然而，在測定血漿中細(xì)胞因子正常濃度時(shí)，難以確定免疫分析法令人滿意的靈敏度。不同細(xì)胞因子的參考值變化很大，難以定義其參考值范圍。如Damas等[7] 在研 究細(xì)胞因子與敗血癥時(shí)，使用兩步免疫放射測定實(shí)驗(yàn)(IRˉMA)測定IL-6(靈敏度:5ng/ml)一步IRMA法測定TNF-α(靈敏度:5ng/L)和IL-1β(靈敏度:4ng/L)，在正常血清中未測得上述細(xì)胞因子。而Riikonen等使用具有相似檢測限的RIA法，在20例健康兒童中，IL-1β的平均濃度為12.1ng/L，IL-6的平均濃度為83ng/L;在71例健康兒童中，TNF-α的平均濃度為40±2ng/L。由此可見，不同的免疫分析方法之間存在*的差異，其靈敏度變化可能是由于其準(zhǔn)確度和特異性的不同而引起。

3 準(zhǔn)確度和特異性

影響細(xì)胞因子檢測準(zhǔn)確度和特異性的因素有:(1)抗體:單抗的表位識別;(2)細(xì)胞因子:多種分子形式，結(jié)合蛋白復(fù)合物、抑制劑和可溶性受體復(fù)合物;(3)血漿基質(zhì):干擾抗體，異嗜性抗體和類風(fēng)濕因子;(4)標(biāo)準(zhǔn):重組參考物質(zhì)可能不顯示與樣品平行的劑量———反應(yīng)曲線。

3.1 細(xì)胞因子結(jié)合蛋白 已知IL-1β、TNF-α和IL-6能結(jié)合從細(xì)胞進(jìn)入血漿的可溶性受體或特異的拮抗劑。免疫分析法是否能識別這樣的結(jié)合形式幾乎是未知的，但是對TNF的研究得出了一些重要結(jié)論。20世紀(jì)80年代后期，《Lancet》上發(fā)表了大量關(guān)于癌癥病人TNF-α測定缺乏可靠性和生物分析法與免疫分析法關(guān)系的文章。但使用競爭性免疫分析法時(shí)，癌癥病人與敗血癥病人的TNF-α是可被檢測的。而ELISA法由于不能測定TNF-α與P 55 TNF受體的結(jié)合物而無法測定癌癥病人血漿中的TNF-α。

3.2 血漿中包含幾種形式的IL-6分子，它們與一些抗血清的作用較弱，缺乏生物學(xué)活性并與其它血漿蛋白質(zhì)以及IL-6的可溶性受體組成復(fù)合物。已知IL-6免疫分析法和生物分析測定其在正常血清中的濃度為0或在10～75ng/L范圍，敗血癥病人的IL-6濃度升高到1～2μg/L，腦膜炎病人的IL-6濃度升到200μg/L。然而，May等說明大多數(shù)的檢測方法僅僅測定了低分子量的IL-6，他們采用能識別IL-6高分子量的單抗，測得在正常血清中IL-6的濃度為1～10μg/L，并且在1例骨髓移植后病人的血清樣品中，測得IL-6的濃度為5～10mg/L。

3.3 多種分子的形式 一些細(xì)胞因子的多種分子形式已被充分認(rèn)識，但是其對細(xì)胞因子測定影響的重要性并未得到*的研究。IL-6是一個(gè)的例子，它由一個(gè)位于第7染色體上，包含5個(gè)外顯子的單一多杰基因編碼。其氨基酸序列包括幾個(gè)潛在的O-糖基位點(diǎn)，2個(gè)N-糖基位點(diǎn)和幾個(gè)*磷酸化位點(diǎn)。由細(xì)菌產(chǎn)生的重組IL-6的相對分子量為21Kd。人成纖維細(xì)胞至少分泌6種形式，相對分子量為23～30Kd的IL-6，它們均是糖蛋白，能在敗血癥病人的血漿中被檢測。人內(nèi)皮細(xì)胞分泌一種分子量為45Kd的IL-6，它似乎是血漿中的IL-6的主要存在形式。

3.4 人血漿中的干擾物質(zhì) 血漿中通常包含有與IgG反應(yīng)的抗體。細(xì)胞凋亡檢測這些異嗜性的抗體可影響夾心免疫分析法，它們在俘獲抗體和被標(biāo)記的抗體間形成橋梁，而錯(cuò)誤地導(dǎo)致高分析值。研究表明，15%～40%的病人樣本中含有能夠干擾檢測的抗體。異嗜性抗體能與鼠、兔和牛血清免疫球蛋白發(fā)生反應(yīng)，在大多數(shù)情況下，它們與牛IgG的結(jié)合強(qiáng)。在檢測中，加入正常的非免疫動(dòng)物血清吸附異嗜性抗體，常能夠消除這種形式的干擾。

3.5 類風(fēng)濕因子是IgM的自身抗體 Hamilton等的研究說明，IgM類風(fēng)濕因子與鼠IgG的結(jié)合發(fā)生于1%的健康獻(xiàn)血者和31%的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人。然而，也有研究表明，在9.1%的正常獻(xiàn)血者中發(fā)生了這類結(jié)合。這些抗體可造成與異嗜性抗體*相同的影響，并且他們在對細(xì)胞因子檢測具有特別意義的類風(fēng)濕病患者中的濃度*。

*    2～8℃    二苯基聯(lián)苯胺    10毫升
進(jìn)口/國產(chǎn)    2～8℃    乙胺鹽酸鹽    10毫升
*    RT    1，7-庚二胺    25克
*        丙二酰胺    100克
*        N-甲基乙酰胺    500克
進(jìn)口/國產(chǎn)    保存：-20℃    4-硝基乙酰苯胺    1克
*    保存：-20℃    正丙醇胺    100毫克
*    2～8℃    異丙醇胺    1克
*        水楊酰苯胺    5克
進(jìn)口/國產(chǎn)    2～8℃    丁二酰亞胺    250毫克
*        對氨基苯磺酰胺    1克
*    保存：-20℃    甲苯-4-磺酰胺    100毫克
*        三異戊胺    500毫克
進(jìn)口/國產(chǎn)        鹽酸三乙胺    1克
細(xì)胞凋亡檢測