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多維度+深度的生物藥表征：全新一代Exploris 240質(zhì)譜

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賽默飛在今年質(zhì)譜年會上重磅推出兩款智能化Exploris系列質(zhì)譜——Orbitrap Exploris™ 120和Orbitrap Exploris™ 240。之前兩期wei信稿已經(jīng)詳細(xì)介紹了其在代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用，本期小編將分享下Orbitrap Exploris 240在生物藥表征中的應(yīng)用，Exploris 240具有高靈敏度、高分辨率和高質(zhì)量精度等特性可確保其采集的數(shù)據(jù)可信可靠，因此在該簡單、靈活、穩(wěn)定的質(zhì)譜分析平臺上可實(shí)現(xiàn)生物藥多維度的深度的表征分析。

愛爾蘭國家生物工藝研究培訓(xùn)所（NIBRT）是賽默飛的合作者，他們用 Exploris 240對單抗樣品進(jìn)行了肽圖和二硫鍵的分析；非變性分子量和電荷變異體的分析；以及多維度氧化翻譯后修飾的深度表征分析，具體的應(yīng)用實(shí)例見下文。

應(yīng)用實(shí)例1: IgG2單抗的肽圖和二硫鍵分析

在肽圖分析中一級氨基酸序列分析可確定抗體序列的正確性，產(chǎn)品相關(guān)關(guān)鍵質(zhì)量屬性的低豐度翻譯后修飾的鑒定和監(jiān)測可以確保藥物的質(zhì)量、療效和安全，二硫鍵能保持生物藥的穩(wěn)定和確保其功能正常，所以肽圖和二硫鍵分析是生物藥表征*的項(xiàng)目。在Exploris 240質(zhì)譜平臺對IgG2單抗Denosumab進(jìn)行肽圖和二硫鍵的常規(guī)表征分析，分析流程如下圖所示。

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在肽圖分析中需要獲得高序列覆蓋率，CDRs區(qū)和關(guān)鍵區(qū)域需要被檢測到。得益于Exploris 240的高選擇性、高捕獲率和高靈敏度等特性，Denosumab僅用一種酶切的結(jié)果中，輕重鏈蛋白序列覆蓋率即均達(dá)到，表明蛋白序列正確。

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高靈敏度使得低豐度翻譯后修飾能輕松被檢測到，下圖為低豐度的脫酰胺翻譯后修飾，一級質(zhì)譜提供高質(zhì)量精度的結(jié)果，質(zhì)量偏差小于3 ppm，通過二級譜圖中特征碎片b2和b3離子對脫酰胺修飾位點(diǎn)定位充分確定。

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比較還原和非還原Denosumab樣品來確定其二硫鍵的連接方式，鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵均鑒定到，一級質(zhì)量偏差均小于3 ppm。

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小結(jié)：

Orbitrap Exploris 240可以用于生物藥的常規(guī)表征，僅用一種酶切即可實(shí)現(xiàn)抗體輕重鏈序列覆蓋，高靈敏度帶來高可信的低豐度翻譯后修飾的鑒定結(jié)果，高分辨率帶來超高的質(zhì)量精度鑒定結(jié)果，Biopharma Finder對復(fù)雜數(shù)據(jù)分析輕松得到可信的鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵鑒定結(jié)果。

應(yīng)用實(shí)例2: 非變性條件下對IgG1單抗變異體的高靈敏度表征

非變性條件下獲得的蛋白分子量質(zhì)譜圖與變性條件下相比，其電荷價態(tài)之間能有更大的空間分離和更少的重疊狀態(tài)。通過液相分離酸性和堿性蛋白異構(gòu)體后質(zhì)譜檢測蛋白質(zhì)平均質(zhì)量和保留時間對單抗電荷變異體（CVA）進(jìn)行鑒定。

Orbitrap Exploris 240非變性質(zhì)譜和CVA分析流程如下圖所示，其中非變性質(zhì)譜使用尺寸排阻色譜(SEC)分離和CVA使用陽離子交換色譜(CEX)分離。

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SEC-MS分析曲妥珠單抗稀釋液，上柱量0.05-50.0 μg，在m/z 5000到7000所有數(shù)據(jù)點(diǎn)都能清楚地檢測到，繪制相對于上樣量和多個電荷價態(tài)歸一化強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測限LOD = 0.03μg，定量限LOQ = 0.08μg。從結(jié)果可知，Exploris 240分析低含量的蛋白質(zhì)不影響譜圖質(zhì)量，檢測低含量的糖基化修飾是可行的。

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CEX-MS CVA分析需要非常高的質(zhì)譜靈敏度，以確保對低豐度電荷變異體的可靠鑒定。2號單抗的CEX-MS分析顯示，與未修飾樣品相比，該突變樣品具有豐富的酸性異構(gòu)體，對應(yīng)的是脫酰氨類的洗脫早于未修飾的成分。在BPC圖中也觀察到其他形式的異構(gòu)體（如：加K和片段化的形式），所有的異構(gòu)體豐度都≤3%。

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小結(jié)：

Orbitrap Exploris 240非變性質(zhì)譜操作簡單，獲得的數(shù)據(jù)譜圖信噪比高和質(zhì)量精度高。在非變性質(zhì)譜條件下進(jìn)行完整的分子量分析，具有超高的靈敏度，可以對痕量樣品進(jìn)行可靠的分析。離子交換色譜結(jié)合Exploris 240的可以在有限的樣本量研究中對單抗的異質(zhì)性進(jìn)行深入的表征和可靠的鑒定。

應(yīng)用實(shí)例3: 在完整蛋白、亞基和肽段水平對IgG1單抗氧化翻譯后修飾的多維度表征

氧化是生物藥在生產(chǎn)和存貯中發(fā)生的常見的翻譯后修飾之一，甲硫氨酸尤為敏感，氧化修飾作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性會影響到終藥物的安全性和有效性，需要被檢測和監(jiān)測。Exploris 240高分辨質(zhì)譜可以鑒定到低豐度的氧化修飾和在肽段水平提供特征的二級碎片離子進(jìn)行位點(diǎn)鑒定，確保鑒定結(jié)果的可信可靠。

單抗Ipilimumab和golimumab分別從蛋白、亞基和肽段水平進(jìn)行分析以評估氧化的情況，分析流程如下圖所示。

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完整蛋白水平氧化翻譯后修飾的鑒定：如下圖所示，對比Ipilimumab對照品和強(qiáng)制氧化樣品，放大其中一個52+電荷價態(tài)質(zhì)譜峰，糖型峰基線分離，信噪比高，3個糖型的質(zhì)量偏差小于4 ppm，強(qiáng)制氧化的樣品與對照品相比有約64Da的質(zhì)量差值，表明在完整蛋白水平可能有4個甲硫氨酸發(fā)生了氧化修飾

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亞基水平氧化翻譯后修飾的鑒定：Ipilimumab用Ides酶解和TCEP還原后得到Fc/2，LC和Fd’亞基，如下圖所示在mAbPac色譜柱上3個亞基得到非常好的分離。放大28+質(zhì)譜峰可見三組樣品（對照，50 ppm H2O2和500 ppm H2O2強(qiáng)制氧化樣品）質(zhì)譜峰基線*分離，電荷價態(tài)可識別，BioPharma Finder軟件用Sliding window xtract算法對他們進(jìn)行去卷積，得到各亞基單同位素分子量和檢測到Fc/2亞基的氧化形式。

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肽段水平氧化翻譯后修飾的鑒定：如下圖所示，檢測到重鏈胰酶酶切肽段DTLMISR上發(fā)生約+15.9949 Da的質(zhì)量差值，表明強(qiáng)制氧化的樣品甲硫氨酸上發(fā)生氧化修飾。發(fā)生修飾和未發(fā)生修飾的樣品一級質(zhì)量精度高，質(zhì)量偏差均小于1ppm。二級譜圖中特征碎片y5和y6離子能確定氧化修飾發(fā)生的位置，以及譜圖中中性丟失64 Da (CH3SOH)碎片離子進(jìn)一步提高結(jié)果的可信度。

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肽圖水平氧化翻譯后修飾的鑒定結(jié)果跟完整蛋白，亞基水平氧化翻譯后修飾結(jié)果相互驗(yàn)證、相互支持。Biopharma Finder軟件自動計算出ipilimumab 和 golimumab氧化修飾比例。在ipilimumab高濃度的雙氧水中甲硫氨酸氧化修飾比例都增加，從4個甲硫氨酸氧化發(fā)生的比例和氧化速率的不同，可以推測Fc端更多暴露在單抗的外表面，從而更容易被氧化。

小結(jié)：

Exploris 240質(zhì)譜提供在完整蛋白、亞基和肽段水平上可信的檢測和監(jiān)測單抗的CQAs平臺，操作簡單，質(zhì)量準(zhǔn)確性高。在完整的單抗水平上，對大多數(shù)的糖基化修飾的完整蛋白分子量的質(zhì)量偏差小于4 ppm。通過與BioPharma Finder 4.0軟件相結(jié)合，使用滑動窗口和Xtract去卷積算法能夠快速、可信的對單抗亞基和低水平內(nèi)源性氧化翻譯后修飾質(zhì)譜數(shù)據(jù)去卷積，得到單同位素峰分子量。肽段鑒定一級質(zhì)量精度高，一級質(zhì)量偏差小于1ppm，鑒定結(jié)果可信可靠。

此外，值得一提的是從控制儀器，數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)分析和生成報告都可以在變色龍軟件中進(jìn)行，對于后續(xù)將Exploris 240用于QC分析提供保證，該平臺完*全符合法規(guī)的要求。

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結(jié)語

在生物藥發(fā)現(xiàn)、開發(fā)、CMC和QC不同階段對質(zhì)譜需求不同，賽默飛基于orbitrap高分辨質(zhì)譜在生物制藥各個環(huán)節(jié)都有完整的解決方案。Exploris 240優(yōu)異的性能使得能對生物藥更加全面和深度的表征，在生物藥的檢測和監(jiān)測中得到更加優(yōu)異的數(shù)據(jù)，同時還能減少分析時間，帶給用戶更*的分析性能和體驗(yàn)。

重磅 6月16日

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