?生物制藥微課堂|第二期-宿主細(xì)胞殘留蛋白如何分析？5分鐘了解前沿

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本期放送

上一場(chǎng)微課堂，為您詳解了：?jiǎn)慰寺】贵w肽圖分析的挑戰(zhàn)及方案，本期，讓我們來(lái)談?wù)勆镏扑幹欣@不開(kāi)的難點(diǎn)話題：宿主細(xì)胞殘留蛋白分析。

什么是微課堂：

為了更好地服務(wù)中國(guó)生物制藥企業(yè)接軌前沿法規(guī)與趨勢(shì)，賽默飛開(kāi)啟名為: Leaders in BioPharmaceutical Characterization and Control的系列微課堂，為您帶來(lái)前沿的生物藥表征與質(zhì)控的*實(shí)踐，一探生物藥“創(chuàng)新”與“質(zhì)量”的世界前沿。”

Host Cell Proteins: Analyzing Impurity in Biopharmaceuticals

講師介紹

Amy Claydon博士是賽默飛生物制藥客戶解決方案中心高級(jí)應(yīng)用科學(xué)家。在此之前，Amy擔(dān)任克勞福德科學(xué)公司（Crawford Scientific）的技術(shù)顧問(wèn)，為來(lái)自眾多行業(yè)的分析人員開(kāi)設(shè)了色譜和質(zhì)譜多方面的課程。在獲得博士學(xué)位之后，艾米還在利物浦大學(xué)（University of Liverpool）擔(dān)任了近5年的博士后研究員，主要方向?yàn)槭褂梅€(wěn)定同位素標(biāo)記和Orbitrap技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)動(dòng)態(tài)變化研究。

5min速覽版：

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看點(diǎn):宿主細(xì)胞殘留蛋白分析的難點(diǎn)及解決方案

通過(guò)工程細(xì)胞重組技術(shù)生產(chǎn)的生物制品，在宿主細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)蛋白的同時(shí)，宿主細(xì)胞本身的蛋白質(zhì)也會(huì)部分表達(dá)，產(chǎn)生相關(guān)雜質(zhì)。殘留的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)不可預(yù)測(cè)的免疫反應(yīng)，因此需要通過(guò)工藝純化使得終產(chǎn)品中的HCP的殘留量盡可能低（<100ppm），并建立良好的方法來(lái)檢測(cè)HCP。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是目前HCP檢測(cè)的常見(jiàn)方法，然而開(kāi)發(fā)特定工藝的ELISA試劑非常耗時(shí)（六個(gè)月以上）且開(kāi)發(fā)成本昂貴，并只能測(cè)定HCP總量，而不能對(duì)每種蛋白進(jìn)行鑒定和定量。其次，通用的ELISA試劑盒的專(zhuān)屬性差，無(wú)法*覆蓋樣品中全部HCP種類(lèi)。LC/MS由于高分辨高靈敏度等優(yōu)異性能，可對(duì)生物制品中的HCP進(jìn)行全面鑒定和定量分析（定量下限可達(dá)1ppm以內(nèi)，動(dòng)態(tài)范圍5-6個(gè)數(shù)量級(jí)）。對(duì)于生物制藥而言，使用更加先進(jìn)準(zhǔn)確的分析方法，獲得更加準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)是至關(guān)重要的，更有助于通過(guò)申報(bào)與審批。

難點(diǎn)

LC/MS分析HCP主要的難點(diǎn)在于結(jié)果的重現(xiàn)性和可靠性，要求高效液相及高分辨質(zhì)譜本身具有的良好的重現(xiàn)性，在數(shù)據(jù)分析上也要進(jìn)行嚴(yán)格篩選，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中至少兩次鑒定到該蛋白，且unique peptide≥2。此次報(bào)告中提出了一套完整的HCP分析方法流程：使用Lilly禮來(lái)^[1]的非變性蛋白酶解方法，將抗體和雜蛋白分離(smart digest試劑盒及KingFisher能夠嚴(yán)格控溫、且前處理高效)；高效液相色譜（使用常規(guī)液相即可得到理想的結(jié)果）及質(zhì)譜的高度重現(xiàn)性使鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確，Proteome Discoverer嚴(yán)格的數(shù)據(jù)篩選及Biopharma Finder深度表征分析，可定量<1ppm的蛋白，且重現(xiàn)性良好。

賽默飛HCP鑒定和定量方案

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液相重現(xiàn)性良好：8針VS18針進(jìn)樣

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如果使用Orbitrap高分辨質(zhì)譜平臺(tái)Exploris 480，能夠?qū)崿F(xiàn)鑒定靈敏度及動(dòng)態(tài)范圍的進(jìn)一步提高。那么如何進(jìn)行合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)？質(zhì)譜方法的參數(shù)設(shè)置？鑒定結(jié)果可做到什么程度？這些問(wèn)題都會(huì)在此次報(bào)告中給出答案，精彩不要錯(cuò)過(guò)！

NIST mAb MS2 data acquired from exploris 480

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參考文獻(xiàn)：

1. A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies. Anal Chem. 2017 May 16;89(10):5436-5444.

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