干細胞粘著碳烴化合物法(microbial adhesion to hydrocarbons，MATH)可以對細胞表面疏水性進行定性分析，有助于理解細胞溶劑耐受性的變化。采用MATH法分別測定了E. coli JM109與E. coli JM109/pQE80L-spy和E. coli JM109/pQE80L-nlpE對丁醇、甲苯、乙酸丁酯和環(huán)己烷的粘附率。相比對照菌株，Spy過表達導致細胞對丁醇和乙酸丁酯粘附率降低，而NlpE過表達導致細胞對這兩種溶劑的粘附率增加。粘附率升高表明細胞表面與待測溶劑性質(zhì)趨于相似，溶劑的吸附和攝入量增大，這與過表達NlpE導致細胞對丁醇和乙酸丁酯的耐受性降低的結(jié)果一致。反之粘附率降低，導致溶劑的粘附和攝入降低，有助于降低丁醇的毒性，提高對丁醇的耐受性。Spy和NlpE重組菌株對環(huán)己烷和甲苯的粘附率均降低，表明重組菌株細胞對這兩種溶劑的粘附能力降低，因而可在一定程度上緩解其對細胞的毒性，這與2.4中環(huán)己烷和甲苯對重組菌株生長影響的結(jié)果一致。此外，四氫呋喃為親水性溶劑，可充分溶解于緩沖液中，因而水相菌體濃度的監(jiān)測難度較大，無法用MATH法準確測定其粘附率。綜上，不同細胞對同一溶劑的粘附率越大，即細胞表面的疏水性越強，溶劑對細胞的毒害作用越大(耐受性低)，反之則越小(耐受性高)。
研究重組菌株對不同溶劑的耐受性可對其機制有更全面的認識，更好地指導溶劑耐受菌在發(fā)酵和生物催化等方面的應(yīng)用。因此選取了具有不同疏水性和極性的溶劑(甲苯、四氫呋喃、環(huán)己烷和乙酸丁酯)，考察重組菌株對它們的耐受性規(guī)律。當菌株生長至OD600為0.8時，分別添加0.1% (V/V)甲苯、0.6% (V/V)四氫呋喃、0.6% (V/V)乙酸丁酯和0.6% (V/V)環(huán)己烷，并繼續(xù)培養(yǎng)10 h，生長曲線如圖 7。首先，對照菌株在上述溶劑條件下均幾乎不能生長或者自溶，說明大腸桿菌本身不能耐受上述溶劑。過表達spy的菌株在甲苯、四氫呋喃和環(huán)己烷溶劑刺激下，其OD600可由初始的0.79分別增長到0.94、0.92和0.97，在乙酸丁酯中幾乎不能生長。過表達nlpE的菌株在四氫呋喃、甲苯和環(huán)己烷溶劑刺激下，其OD600可由初始的0.80分別增長到0.83、0.92和0.87，與對照菌株相近，乙酸丁酯的加入導致細胞裂解，OD600下降。結(jié)果表明，重組菌株pQE80L-spy在對于甲苯、環(huán)己烷、四氫呋喃、丁醇四種有機溶劑的耐受性方面具有良好的遺傳優(yōu)勢。Spy表達量的提高不僅提高胞內(nèi)許多參與物質(zhì)運輸、輔助蛋白折疊的分子伴侶的活性，干細胞還激活了Bae以及Cpx雙組分壓力應(yīng)答途徑。為了抵抗有機溶劑對細胞的危害，受BaeR和CpxR調(diào)控的一系列編碼能量代謝以及維持細胞膜穩(wěn)定性的基因大量表達，從而緩解溶劑帶來的生長壓力。另一方面，NlpE的過表達提高了細胞對甲苯和環(huán)己烷的耐受性，相反對短鏈醇類(丁醇)的刺激卻沒有發(fā)揮出預(yù)想的作用。
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