在ELISA試劑盒免疫酶技術(shù)中，首先要確定的變異因素就是酶標(biāo)記物的工作濃度。因為酶標(biāo)記物濃度的很小變化，便可導(dǎo)致試驗結(jié)果產(chǎn)生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應(yīng)增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標(biāo)抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應(yīng)，以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來確定酶標(biāo)記抗體的效價，或稱工作濃度。
其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml，4℃隔夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標(biāo)記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定)，分別加入反應(yīng)孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反應(yīng)。
結(jié)果判定主要以ELISA試劑盒比色儀讀取各孔OD值。并以O(shè)D為縱座標(biāo)，結(jié)合物濃度為橫座標(biāo)，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率zui大時的酶標(biāo)抗體稀釋度，即為該標(biāo)記物的工作濃度。
有關(guān)試驗的試劑及器材均見ELISA試劑盒部分。
C要說明的是，本法為ELISA試劑盒直接法，所測的工作濃度與在實際應(yīng)用中的zui適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA試劑盒實驗系統(tǒng)中，因此基礎(chǔ)上還應(yīng)進一步確定實際工作濃度(可采用方陣法)，以達到zui適的實驗條件。
注意事項
1. 在具備高質(zhì)量HRP的條件下，所要標(biāo)記的抗體也要活性高,效價高(zui低1∶16),純度高，親和力好，這是保證標(biāo)記物效價高，免疫活性好的首要條件。"
2. 所使用ELISA試劑盒的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑，(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標(biāo)記法中所用戊二醛應(yīng)為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體(雜質(zhì))。否則，影響標(biāo)記效果。
3. 室溫攪拌時須避光，室內(nèi)溫度一般在25℃為宜。標(biāo)記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液。
4. ELISA試劑盒濃的標(biāo)記物相當(dāng)穩(wěn)定，常加入30～40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀釋成1∶10，只能保存數(shù)周。ELISA試劑盒已配制的使用液應(yīng)在12小時內(nèi)用完。切忌反復(fù)凍融。
