（一）ELISA試劑盒(酶聯免疫剖析試劑盒)前史：
ELISA試劑盒自從60-70時代面世以來，得到*科研作業(yè)者的認可及推崇，在歐美及我國獲得很大的推行，尤其是國內生化領域的長足發(fā)展。 Elisa生物試驗是一種敏感性高，特異性強，重復性好的試驗確診方法。由于其試劑安穩(wěn)、易保存，操作簡潔，成果判別較客觀等要素，已廣泛應用在免疫學查驗的各領域中。ELISA試劑盒可檢測樣本：體液、血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液、尿液、組織勻漿、心房水標本等等。ELISA試劑盒在國內有許多種叫法：例如：ELISA檢測試劑盒、ELISA Kit、酶聯免疫試劑盒、酶聯免疫吸附測定試劑盒、酶聯免疫剖析試劑盒、酶免試劑盒等，比較常見的叫法是ELISA檢測試劑盒、酶聯免疫吸附測定試劑盒等。
（二）科研ELISA試劑盒操作怎么讓ELISA體系更安穩(wěn)：
ELISA檢測體系可謂是免疫學反響應用到科研出產中zui為活絡的技術手段。但是在新老手操作過程中總是會呈現或大或小的問題，本人在剛開始做ELISA時就面對許多困難，雖然有師兄師姐鋪路，但仍是常常做得烏煙瘴氣，比方說花板，假陽性，全顯色，悉數顯色，顯色比空白還低,自己也為此苦惱過很長一段時刻，跟著自己技術水平得進步，或多或少地也把握了ELISA體系的脾氣，也是游刃有余吧，現在做方陣，做ELISA已是駕輕就熟了，曾經檢測一種抗體用整整一下午還算得暈暈的，現在給我十個八個的從包被到顯色，一個作業(yè)日根本搞定。下面就由我拋磚引玉地來說一下，做ELISA的經驗總結:
1、包被原的性質很重要，蛋白濃度，是否降解，這到你做出的抗體可不能夠被其辨認，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時，師兄都嚴厲正告我必定要在冰浴下緩慢消融就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白，關于*和脂類物質或小分子物質我們要事先對其改造再加以包被，我把方法扼要的列出如下:①親和素*:先親和素先包被載體，參加*化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴展應用于各種抗原物質的定量測定。②脂類物質:可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后參加ELISA板孔中，開蓋置冰箱guo ye或涼風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質天然干固在固相外表。③小分子有必要依托和大的蛋白載體偶聯后才能固定在固相載體上。
2、包被液的挑選，一般挑選ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于試驗的需求，包被原的特殊性也可能選用中性的緩沖溶液來包。應留意以下原理：由于蛋白質與聚苯乙烯固相載體是經過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體外表的疏水基團間的效果，這種物理吸附對錯特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質較小分子蛋白質一般含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體外表。具體的試驗還要有鞏固的理論外也要實踐，看一下終究可不能夠應用到自己試驗當中去。常用的包被液除了剛才說到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
3、關閉：繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。關閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空地，從而排擠ELISA后的過程中攪擾物質的再吸附。常用關閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價廉，能夠高濃度運用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(首要為了掃除類似蛋白攪擾)和酪蛋白等等。但終究選用什么，要依據試驗具體來實踐。
4、洗刷板：能夠說在ELISA操作中，洗刷是zui首要的關鍵技術。由于聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，為達到別離游離的和結合的酶符號物的意圖，鏟除殘留在板孔中游離的物質，以及非特異性地吸附的攪擾物質，在洗刷時又應把這種非特異性吸附的攪擾物質洗刷下來。所以在洗板時會有必定差錯，人為要素很大(當然有條件的用洗板機在外)，洗的不*或串了孔，對如此活絡的ELISA體系但是不小的影響。
5、加抗體標本(和二抗):留意該換槍頭時換槍頭。標本稀釋一般可用pbs稀釋，也可用關閉液去稀釋。如需加二抗，還要留意二抗的作業(yè)濃度，太低則上色淺。
6、顯色:顯色體系又許多，我們一開始做的時分，要挑選適合的顯色體系。留意顯色體系酶活性底物的保存HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉。
7、每次做盡量要把陰陽空三個對照做好，如呈現問題也好剖析。
（三）相關常識：
1、問：做直接Elisa法測試小鼠血清中的IgE抗體，設空白對照、和陰性對照、陽性血清稀釋倍數為5千、1萬、10萬、20萬不等，用的是*符號的羊抗鼠IgE抗體，和親和素的辣根過氧化物酶。但是成果除了空白對照孔沒有色彩外，其他各孔全有色彩，而且OD值都相差不大，為什么?
答復：可能原因如下：
(1) 水質被金屬離子等污染;避免方法盡量運用新鮮水或蒸餾水。
(2) 洗刷不充沛，樣品中其它成分殘留或酶殘留;避免方法洗刷液應注滿微孔，充沛洗刷。
(3) 移液頭重復運用，未洗凈或消毒不*; 避免方法移液頭一次性運用。
(4) 酶標板活絡度過高。
(5) 一抗顯色時刻的操控等等，關于ELISA的每一步都要留意才行。
2、ELISA加樣時的防錯小經驗
(1)用一張寫滿字的紙，字越多越好，比方報紙，墊在下面，這樣，加過標本的小孔看過去下面的字會變小，沒加的字正常，十分簡單區(qū)別。
(2)能夠使用液面反光與沒有加的孔加以差異
(3)在標本加完后，再把加樣槍全壓下，使液面發(fā)生小氣泡，也能夠加以區(qū)別
3、棋盤試驗的操作方法:
(1)將抗原按必定的梯度倍比稀釋后，依照ELISA從上到下(或許從左到右)的順序包被。
(2)將抗體按必定的梯度倍比稀釋后依照ELISA從左到右或許從上到下參加。
(3)二抗的稀釋倍數是必定的，然后顯色，讀值。
ELISA試劑盒OD值的測守時，波長要依據顯色劑的不同而定，一般上我們都運用TMB顯色，450nm讀值。依據讀值得成果能夠選定適宜的抗原和抗體效價，這就是棋盤 試驗的意圖，如果抗原包被量已知而二抗的作業(yè)濃度不確定的話就用一抗和二抗作棋盤試驗。
