細(xì)胞培養(yǎng)步驟：
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備MEM培養(yǎng)基(MEM:GIBCO,貨號11095-080)，85%；北美胎牛血清(United States，GIBCO，貨號16000-044)，15%。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%*培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
二．細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。

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細(xì)胞株的培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)：
用于檢測細(xì)胞因子的細(xì)胞株通常培養(yǎng)于含10％小牛血清和抗生素的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)對細(xì)胞因子有依賴性的細(xì)胞株時(shí)還有加入適量細(xì)胞因子。在37℃ 5％ CO2 的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長特性，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候進(jìn)行傳代，一般3～4 天傳代一次。
懸浮生長細(xì)胞的傳代：
直接離心后吸去培養(yǎng)上清液，用新鮮培養(yǎng)液稀釋懸浮細(xì)胞，一般按1：2-1：5 稀釋細(xì)胞后，分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
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實(shí)驗(yàn)操作步驟：
a．采用認(rèn)可的方案處死人皮膚成纖維細(xì)胞,CCC-HSF-1細(xì)胞嚙齒動物。   
b．立即在無菌超凈臺內(nèi)用70％乙醇擦洗整個(gè)動物。 
c．用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。   
d．用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養(yǎng)皿上。   
e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的100ml燒杯中。   
f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 50ml 配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶
2. 100ml滅菌燒杯2個(gè)； 人皮膚成纖維細(xì)胞,CCC-HSF-1細(xì)胞
3、50ml離心筒2個(gè)
4、滅菌培養(yǎng)皿1個(gè)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶1個(gè)
5、1ml ，200μl移液器各1支；槍頭盒2個(gè)；無菌玻璃攪拌棒1個(gè)
6、細(xì)胞計(jì)數(shù)板1塊；
7、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把；
8、酒精燈1臺；

冰凍切片膠原纖維（GIESON）染色試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：50次

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PrimaCell™大鼠冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞試劑盒3-溴吡分子式：158英文名稱：3- bromide號：626-55-1分子量： C5H4BrN

4-氯-3-硝三氟甲氧分子式：英文名稱：4- -3- nitro group three號：4324535分子量：

1,5-二硝萘分子式：218.17英文名稱：1,5- two nitro naphthalene號：605-71-0分子量： C10H6N2O4

鄰硝對甲砜甲分子式：215.23英文名稱：Ortho para nitro group for toluene號：1671-49-4分子量： C8H9NO4S

1,2,3-三氯英文名稱：1,2,3- three分子式：181.45分子量： C6H3Cl3號：87-61-6

喹啉酸分子式：167.12英文名稱：Acid號：89-00-9分子量： C7H5NO4

對三聯(lián)分子式：230.31英文名稱：To three號：92-94-4分子量： C18H14

7-硝喹啉分子式：174.16英文名稱：7- nitro group號：613-51-4分子量： C9H6N2O2

3,5-二氯溴分子式：225.9英文名稱：Two - 3,5- chloride號：19752-55-7分子量： C6H3BrCl2；BrC6H3Cl2

堿性藍(lán)G英文名稱：Alkaline blue G分子式：分子量：號：

牛蒡子苷元英文名稱：Niubangzi Gan Yuan分子式：372.41分子量：C21H24O6號：7770-78-7