隨著分子生物學(xué)和ATCC細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞水平的研究日益受到重視。體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞可保存其結(jié)構(gòu)及功能上的某些特點，具有自發(fā)性搏動，可在不受神經(jīng)、體液因素的影響下，直接進(jìn)行心肌細(xì)胞的生理、病理、藥理、毒理及能量代謝等方面的研究以及從培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中提取有價值的生物因子，心肌細(xì)胞培養(yǎng)有著廣闊的應(yīng)用前景。根據(jù)Simpon的方法并稍加改進(jìn)培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞敘述如下：

1. 將胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的濃度，并放置于 37℃水浴中溫育好。

2. 解剖取材：將乳鼠放入 0.1%新潔爾滅浸泡一下后拿出，用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露，右手取一把眼科直剪剪開皮，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。這樣只要左手稍頂，乳鼠的心臟就直接跳出來。然后用眼科彎鑷從心臟中部直接將心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。重復(fù)以上過程。取材完畢后，撤掉取材的手術(shù)器械。注：為了保證心肌細(xì)胞的活力，取心的操作過程盡量快，另外，把盛的心臟的培養(yǎng)皿放置在冰臺上或者預(yù)冷的平衡鹽液中。

3. 用第二套手術(shù)器械進(jìn)行下列操作。用眼科直鑷和眼科彎剪把培養(yǎng)皿中的心臟周邊的血凝塊及纖維組織剔除掉，放在另一個預(yù)先裝好D-Hank's液的培養(yǎng)皿中，把心臟組織再洗一遍后，將心臟組織放在另外一個培養(yǎng)皿中，加少許 0.06%胰酶，用眼科彎剪將心臟組織剪成 1mm3大小的碎塊，將剪碎的心臟和胰酶液轉(zhuǎn)入加了攪拌子的錐形瓶中，另外吸取 2-3 ml新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉(zhuǎn)入錐形瓶中，補加胰酶至終體積10 ml，加上塞子，放在 37℃水浴中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至 60 rpm左右，消化15 min(務(wù)必保證水浴溫度恒定在 37℃，并且消化時間不超過 15 min)?；蛘?，如果采用的是水浴震蕩器的話，不用加攪拌子，直接放在水浴震蕩器中消化亦可，轉(zhuǎn)速和消化時間相同。

4 . 從水浴中取出錐形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血紅細(xì)胞和成纖維類細(xì)胞。

5 . 加入10 ml 新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液幾次，機械分散細(xì)胞(組織消化后會成為粘稠的膠體狀)，注意：不要過分吹打，否則會導(dǎo)致組織過度消化，37℃水浴攪拌再消化 10-15 min；如果乳鼠數(shù)目少(比如 5、6 只的時候)，消化時間可以減少為 5-10 min，否則很容易消化過度。上述消化處理的同時，往一支 50 ml 的一次性無菌離心管中加入 20 ml 預(yù)冷的含 10%血清的培養(yǎng)液，并放置冰臺上。消化處理之后，小心移出上清轉(zhuǎn)至上述加有培養(yǎng)液的離心管中，*次消化收集的分離出的細(xì)胞，*次消化結(jié)束后；繼續(xù)第二次消化，余下的組織塊加入 10 ml 新胰酶繼續(xù)消化。

6 . 重復(fù) 2.5 消化步驟，直至剩余少許組織塊為止，一般消化 4-5 次可以消化絕大多數(shù)的組織塊(不含棄去消化液的那次)。

7 . 第 1、2 次含細(xì)胞的消化液放在一根離心管中，過 180 目篩網(wǎng)后，一起離心；第 3、4 次含細(xì)胞的消化液放在一根離心管中，過 180 目篩網(wǎng)后，一起離心。Z后，分別用 8 ml含 20%血清的培養(yǎng)液重懸兩管細(xì)胞，接種到一個 75 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，放置在培養(yǎng)箱中 1.5 小時后，取出，棄貼壁細(xì)胞(主要是成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)，將未貼壁的細(xì)胞懸液取出，臺盼籃拒染法計數(shù)后，加入培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5-6x105個/ml，接種到目的培養(yǎng)器皿中。

8 . 一般不用加BrdU，如果培養(yǎng)時間長(發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞也極少)，可以加入 0.1 mmol/ml BrdU(Sigma)以阻止成纖維細(xì)胞增殖。加了BrdU，心肌細(xì)胞搏動的持續(xù)時間會更長。

9 . ATCC細(xì)胞接種后 24 小時，用溫的培養(yǎng)基或者平衡鹽液輕輕沖洗培養(yǎng)的心肌細(xì)胞一次，以去處未貼壁的細(xì)胞(部分細(xì)胞會在 24 小時后貼，結(jié)果很多細(xì)胞重疊生長)，再更換培養(yǎng)液，即可。可以按照實驗需要在培養(yǎng) 48 h 或 72 h 后施加處理因素。
用于空腸彎曲菌的分離培養(yǎng)    Skirrow Agar Base Modified    250克    空腸彎曲菌瓊脂基礎(chǔ)
用于抗生素敏感試驗    Mueller-Hinton Broth    250    MH 肉湯（MHB）   
用于抗生素敏感試驗    Mueller-Hinton Agar    250    MH 瓊脂（MHA）   
用于抗菌素藥物敏感性試驗    MHB    250克    MH肉湯
用于菌苗及生物制品霉菌無菌檢驗    Martin Broth ,Modified    250    改良馬丁液體培養(yǎng)基   
用于軍團(tuán)菌的選擇性分離培養(yǎng)(OXOID方法)    BCYE Agar(Legionella Agar)    250    BCYE 瓊脂(Legionella 瓊脂)
用于金黃色葡萄球菌凝固酶試驗    Rabbit  Plasma    0.5ml*20    兔血漿  
用于金黃色葡萄球菌的增菌培養(yǎng)。每100ml培養(yǎng)基需另加入1%亞碲酸鈉1ml    Sodium lurite Broth Base    250    亞碲酸鈉肉湯培養(yǎng)基基礎(chǔ)   
用于金黃色葡萄球菌的增菌培養(yǎng)。每100ml培養(yǎng)基需另加入1%亞碲酸鈉0.2ml    Beisachang Sodium lurite Broth Base    250    北沙參亞碲酸鈉胨水培養(yǎng)基基礎(chǔ)
ATCC細(xì)胞