實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測(cè)ATCC細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。

細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤
具體操作：

一.準(zhǔn)備工作：

取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)(消化法)》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以被使用.

二.細(xì)胞懸液制備：

用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液(或hanks液或PBS等平衡鹽溶液)，吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液。

三.細(xì)胞計(jì)數(shù)：

1.取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上.

2.制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺(tái)盼藍(lán)染液(0.4%)或苯胺黑。活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。

3.將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

4.統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大鉻(每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻)中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。

5.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：

細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)/ml=(四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×2×104

說明：/4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù);×2因細(xì)胞懸液：染液=1：1稀釋;×104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1mm3 而 1ml=1000mm3

四.細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：

1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中;

2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確;

4.數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。

5. 操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。

五.初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：

1. 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。

2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

3. 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

六.本實(shí)驗(yàn)特殊試劑的配制：

4%臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取4克臺(tái)盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。

使用液：使用時(shí)，用PBS稀釋母液至0.4%即可。

細(xì)胞的凍存

1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。

2.接著置于-20℃冰箱，約30-60min。

3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。

4.置于液氮罐中長期保存。

5同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項(xiàng)：

1.使用DMSO前，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(huì)破華它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對(duì)人體有害，故在配制時(shí)戴上手套操作。

2.不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。

3.注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時(shí)添加。

簡便方法：

胰蛋白酶液消化>>離心>>PBS液1ml洗滌，吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液>>取1ul懸液+9ulPBS>>細(xì)胞計(jì)數(shù)：

1.蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上.

2.用10ul槍頭將細(xì)胞懸液注入計(jì)數(shù)板，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

3.統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大鉻(每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻)的細(xì)胞數(shù)目。

4.計(jì)算原ATCC細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：

(細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù))/ml=(四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×106
對(duì)照品    含量：    進(jìn)口/國產(chǎn)    頭孢克洛    20mg/支    英文名稱    含量測(cè)定    規(guī)格:
對(duì)照品    含量：    進(jìn)口/國產(chǎn)    苯唑西林    20mg/支    英文名稱    含量測(cè)定    規(guī)格:
對(duì)照品    含量：    進(jìn)口/國產(chǎn)    頭孢噻肟    20mg/支    英文名稱    含量測(cè)定    規(guī)格:
對(duì)照品    含量：    進(jìn)口/國產(chǎn)    頭孢他啶    20mg/支    英文名稱    含量測(cè)定    規(guī)格:
對(duì)照品    含量：    進(jìn)口/國產(chǎn)    多西環(huán)素    20mg/支    英文名稱    含量測(cè)定    規(guī)格:
對(duì)照品    含量：    進(jìn)口/國產(chǎn)    克林霉素磷酸酯    20mg/支    英文名稱    含量測(cè)定    規(guī)格:
對(duì)照品    含量：    進(jìn)口/國產(chǎn)    土霉素    20mg/支    英文名稱    含量測(cè)定    規(guī)格:
ATCC細(xì)胞