細胞凋亡形態(tài)學檢測方法

一、光學顯微鏡觀察

凋亡細胞的主要特征為核染色質致密深染，形成致密質塊，有時可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小，胞質致密、嗜酸性染色增強，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在，凋亡細胞與周圍細胞分離，不引起炎癥反應。

本方法簡便易行，但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標，具有較強的主觀性，重復性差。本方法可用于調亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標之一。

檢測方法：細胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細胞的形態(tài)改變，結合顯微測量工具可作凋亡細胞計數(shù)。

二、電子顯微鏡觀察

雖然光學顯微鏡下可以看見胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態(tài)學變化大多發(fā)生在超微結構,因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細胞結構在凋亡不同時期的變化。電鏡形態(tài)學觀察是迄今為止判斷凋亡Z經典、*的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。

缺點：

(1)只能定性,不能定量;

(2)標本處理過程復雜,設備相對昂貴,對檢查者的技術水平要求較高,不適于大批標本檢測;

(3)在組織切片上進行電鏡觀察時,有時凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別,因為兩種情況下都可出現(xiàn)染色質濃聚。如同時進行熒光染色,可彌補電鏡檢查的不足。

檢測方法：透射電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。

三、視頻時差顯微技術

本方法用于細胞培養(yǎng)，通過相差顯微鏡可動態(tài)觀察細胞凋亡的變化過程，尤其是觀察細胞表和外形的變化。凋胞與基質分離，胞體變圓、收縮、出泡，有的細胞拉長，出現(xiàn)釘狀突起，特續(xù)數(shù)小時后細胞膜破裂，細胞溶解，通過連續(xù)觀察，本方法可養(yǎng)壑培養(yǎng)中的凋亡細胞，但不能用于病理組織。

檢測方法：收集2×105細胞/ml培胞，置于多孔培養(yǎng)板，加入凋亡誘導劑，在帶有自動攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細胞的動態(tài)改變，每隔分鐘30秒作序列攝影，連續(xù)24小時。如同進進行熒光染色，可參熒光晃微鏡下觀察和攝影。