細(xì)胞株免疫組化染色基本技術(shù)及注意事項(xiàng)

① 根據(jù)課題的內(nèi)容選用動(dòng)物，選用配套的Ab。如Ab-I鼠抗人的抗體，細(xì)胞株與其他種屬間無 交叉，則不能用其他 動(dòng)物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必須來源于鼠，否則不能連接成復(fù)合物。

② 若要比較染色深淺在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間的差異，在貼片方面貼于同一張載片上，否則無可比性。

③ 選用的試劑可靠，貨源充足，隨時(shí)可取。

2.Ab稀釋度 (如系購(gòu)買的藥盒有工作液和原液)

(1)工作液:無須稀釋

(2)原液:

① 應(yīng)參照其提供的工作液濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)驗(yàn)。

如:工作液濃度為1∶1000， 可選1∶500，1∶1000，1∶1500試驗(yàn);

若: 1∶500有背景，1∶1000陽(yáng)性反應(yīng)稍淺，可選1∶750進(jìn)行試驗(yàn)。

② 原液的保存(-20℃)凍存--應(yīng)選稀度凍存。

③ 若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍，而后分裝10μl/瓶→凍存(-20 ℃)于 冰箱備用。

④ 關(guān)于Ab保存應(yīng)參照說明書。

(3)Ab濃度的選擇

Ab濃度不可太高或太低，因?yàn)锳g-Ab結(jié)合需在一定濃度范圍內(nèi)進(jìn)行，若一方過剩則形成復(fù)合物小且少;極 過剩時(shí)已形成的復(fù)合物亦會(huì)解體而呈現(xiàn)假陰性。--并非Ab濃度越高越好。

3.Ab滴片技術(shù)

-- 細(xì)胞株所滴的抗體應(yīng)與切片上的組織剛好吻合。

[注意] 滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。

要領(lǐng):甩凈組織周圍的水。

4.PBS洗滌技術(shù)

(1)洗滌的目的

① 保證離子濃度和PH值。

② 減少非特異反應(yīng)(平時(shí)Ab不可靠很純)

(2)方法:洗三次，每次5分鐘。

5.Ab孵育技術(shù)

(1)必須在濕盒內(nèi)進(jìn)行，以防抗體的蒸發(fā)和干片。

(2)溫度與時(shí)間 4℃:過夜;

37℃:2 h or 參考說明書

6.光鏡控制顯色方法

(1)室內(nèi)操作:注意溫度與時(shí)間的關(guān)系，室溫Z宜5分鐘。

(2)細(xì)胞株染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。